假单胞菌株M18藤黄绿菌素的生物合成基因簇、调控基因pltZ及其ABC转运基因簇的鉴定与功能研究

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假单胞菌株(Pseudomonassp.)M18产生藤黄绿菌素(Pyoluteorin,Plt)与吩嗪-1-羧酸(Phenazine-1-carboxylicacid,PCA)两种不同类型的抗生素,能抑制多种植物病原菌,是一株重要的生物防治菌株。本研究克隆、测序并鉴定了M18藤黄绿菌素生物合成基因簇及其下游序列共32.8kb的基因组区域,序列分析发现该区域共包含20个开放阅读框(ORF),plt基因簇由位于其中22-kb基因组区域的10个ORF组成:操纵子pltLABCDEFG、转录调控基因pltR、部分pltM基因,M18plt基因簇的基因组成、分布、大小与荧光假单胞菌Pf-5的基本相似。在plt基因簇下游8-kb基因组区域,首次发现并鉴定了一个新的藤黄绿菌素生物合成负调控基因pltZ和一个新的涉及藤黄绿菌素免疫、促进藤黄绿菌素合成与分泌的ABC(ATP-bindingcassette)转运基因簇pltHIJKNO,并预测提出了一个可能的藤黄绿菌素转运机制模型。在pltZ和pltHIJKNO功能鉴定的基础上,本课题还研究证实:pltZ转录阻抑ABC转运系统PltHIJKNO的表达,藤黄绿菌素能同时诱导自身生物合成基因和ABC转运系统PltHIJKNO的表达。研究藤黄绿菌素生物合成的分子调控、转运分泌及自身免疫机制,对于通过基因工程提高抗生素产量及其生物防治能力、实现抗生素生产工业化具有十分重要的意义。 pltZ编编码蛋白质序列与其它TetR家族细菌调控蛋白具有广泛的同源性,PltZ蛋白的第19~65个氨基酸残基间存在一个TetR家族调控蛋白的特征序列模体,其中第23~59个氨基酸残基编码一个HTH(helix-turn-helix)DNA结合结构域。pltZ基因的突变引起藤黄绿菌素合成量比野生型提高4.4倍,而对吩嗪-1-羧酸的合成没有影响。pltZ对藤黄绿菌素生物合成的负调控作用通过pltZ的过表达实验与pltA-lacZ翻译融合分析得到进一步证实。 藤黄绿菌素ABC转运基因簇位于pltZ下游7.5kb基因组区域内,由pltH、I、J、K、N、O六个基因组成,作为一个单独的转录子,在pltZ相反方向转录,生物信息学分析预测显示:这六个基因依次分别编码一个膜融合蛋白PltH、一个Ⅱ型ATP结合蛋白PltI、两个内膜整合通透酶蛋白PltJ与PltK、一个外膜通道蛋白PltN及一个跨膜蛋白PltO,共同组成一个完整的ABC转运系统。Plt的生物合成需要该ABC转运系统的表达,pltH或pltI的突变菌株均未合成可探测水平的Plt,ABC转运系统的过表达显著提高M18菌株合成Plt的能力。在大肠杆菌DH5α菌株中异源表达ABC转运基因簇不同基因或区域,测定该菌株对Plt的敏感性(最小抑制浓度);在含有15μgmL-1和12.5μgmL-1Plt的LB培养基中,分别测定携带完整ABC转运系统表达质粒pZX141的E.coliDH5α与空质粒(pME6032)对照菌株的生长动力学;两实验结果表明:完整的ABC转运系统负责对Plt的免疫或抗性。ABC转运系统对Plt生物合成的促进功能及其Plt抗性机制均可能由该ABC转运系统分泌与外排Plt的功能所介导,就此提出了一个可能的Plt转运机制模型。 在野生型M18菌株和pltZ突变菌株M18Z中,ABC转运基因pltH-‘lacZ翻译、转录融合表达的结果表明:pltZ转录阻抑PltABC转运系统的表达。pltZ有可能通过阻抑PltABC转运系统的表达,间接地负调控Plt的生物合成。 在添加或不添加外源Plt(终浓度10μgmL-1)的KMB培养基中,分别在野生型M18菌株和Plt-突变菌株M18T中进行pltA-‘lacZ翻译融合与pltH-‘lacZ翻译、转录融合表达,结果表明:Plt对自身生物合成基因簇及其ABC转运系统的表达在转录水平上具有显著的诱导作用。
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