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原发性肝癌中,肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)约占其85%~90%的比例,在全球癌症死亡病因里位居第二,每年全球约有100万例以上的新发病例。大多数肝细胞癌起源于一系列的慢性肝损伤,例如乙型肝炎或丙型肝炎病毒感染、酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝、吸烟和黄曲霉素暴露等。在欧美国家酒精性脂肪肝以及非酒精性脂肪肝是诱发肝细胞癌最主要的原因。而在我国,由于病毒性肝炎的传播,占据了全世界每年将近一半的新发病例。尽管我国目前大力推广病毒性肝癌疫苗的接种,但肝癌发病率并没有明显降低,很多患者在没有上述危险因素的情况下依然发生了肝细胞癌,可见是否有其他危险因素或者分子机理需要进一步明确。目前,肝移植和部分肝切除术被认为是肝细胞癌主要的治疗手段。同时,由于肝细胞癌的高复发率、肝脏供体的缺乏、早期肝癌难以察觉、晚期的肝细胞癌患者全身性化疗效果差等因素,使得真正提供给肝细胞癌病人的治疗方案和药物选择十分有限。因此,深入地探究肝细胞癌发病的分子机制,寻找更为有效的临床治疗药物,以提高肝细胞癌患者生存率具有很大的必要性和临床意义。近年来研究发现,苍耳草中提取的倍半萜内酯类的主要药理活性成份苍耳亭(Xanthatin)在乳腺癌、非小细胞肺癌、胃癌以及黑色素瘤中均具有较为明显的抗肿瘤作用。本课题组通过体外分子生物学实验以及体内裸鼠成瘤实验,深入研究苍耳亭对于肝细胞癌恶性生物学特征的影响,并探讨其潜在的分子作用机制。首先观察苍耳亭处理后对人肝癌细胞形态学的影响,光学显微镜下观察可以发现苍耳亭刺激后,人肝癌细胞逐渐皱缩、变圆,并伴有漂浮的死细胞产生,提示苍耳亭对于人肝癌细胞的形态学有一定影响。随后MTT实验显示,苍耳亭可以明显地抑制人肝癌细胞的活力,并且这一作用具有时间和浓度的依赖性。细胞的生长受到影响通常与细胞周期的阻滞以及细胞凋亡的产生有关。本实验中,通过流式细胞术检测苍耳亭处理人肝癌细胞后细胞周期分布以及细胞凋亡情况,结果发现中浓度苍耳亭能明显产生细胞周期阻滞作用,并且诱导细胞凋亡,其中中浓度苍耳亭主要阻滞肝癌细胞于细胞分裂期(G2/M期),而高浓度苍耳亭则主要作用于肝癌细胞的DNA合成期(S期)。通过TUNEL染色以及Annexin-V/PI双染实验也发现了苍耳亭诱导产生的凋亡细胞。Western blot实验观察到苍耳亭处理组细胞中细胞凋亡标志蛋白cleaved-caspase3、Bax蛋白水平增加,抗凋亡Bcl-2蛋白水平降低,证实了苍耳亭可诱导人肝癌细胞的凋亡。接下来,我们通过透射电镜观察到苍耳亭处理组细胞中胞质浓缩,细胞核破裂,内质网膨胀、紊乱,凋亡小体产生,提示内质网应激可能介导了苍耳亭诱发人肝癌细胞凋亡。内质网应激中的未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)是机体诱发细胞凋亡的一种重要机制,其主要通过PERK-eIF2α-ATF4、IRE-XBP1以及ATF6三条信号通路来发挥作用。通过Western blot实验发现,苍耳亭处理后,肝癌细胞中内质网应激相关蛋白GRP78/Bip、PERK、p-PERK、IRE1和ATF6表达水平均上调。为了明确参与苍耳亭抗肝细胞癌作用的信号通路,进一步检测了上述三个信号通路的下游蛋白,虽然发现PERK-eIF2α通路中的eIF2α、p-eIF2α、ATF4以及IRE-XBP1信号通路下游的XBP1蛋白表达水平在苍耳亭刺激后均显著增加,但是,与对照组相比较,PERK-eIF2α-ATF4通路及下游靶蛋白CHOP变化最显著,而IRE/XBP1通路下游靶蛋白ERDJ4和EDEM1表达却无明显改变,提示苍耳亭可能主要通过激活PERK-eIF2α-ATF4信号通路,进而导致肝癌细胞凋亡的发生。并且苍耳亭以及内质网应激诱导剂衣霉素均可以上调CHOP以及cleaved-caspase3的水平,而当沉默肝癌细胞中的CHOP后,均可拮抗苍耳亭以及衣霉素上调cleaved-caspase3的作用,从而佐证了苍耳亭通过PERK-eIF2α-ATF4通路诱导细胞凋亡。PERK-eIF2α-ATF4信号通路的活化依赖于ATF4由细胞质穿梭进入细胞核这一过程。本课题研究发现,苍耳亭处理后,细胞质中的ATF4穿梭进入细胞核内;同时,荧光素酶报告基因检测显示苍耳亭明显增加HepG2细胞中ATF4mRNA的表达以及ATF4基因的转录活性。由此可见,苍耳亭可能通过增加肝癌细胞中ATF4的核穿梭促进PERK-eIF2α-ATF4信号通路介导细胞凋亡。为了进一步证实上述结果,本课题还进行了裸鼠体内实验研究,在雄性BALB/c裸鼠上建立肝癌移植瘤模型。结果发现苍耳亭组小鼠肿瘤体积与增长速度均低于溶剂组小鼠。收集小鼠肝癌肿瘤组织,进行免疫组化实验,可明显观察到苍耳亭组小鼠cleaved-caspase3、GRP78/Bip、PERK、ATF-4、p-eIF-2α以及CHOP表达阳性的细胞多于溶剂对照组;Western blot实验结果同样发现相比较于对照组,苍耳亭处理组中GRP78/Bip、CHOP以及cleaved-caspase3水平上升,上述结果在体验证了内质网应激PERK-eIF2α-ATF4信号通路介导了苍耳亭诱导肝癌细胞凋亡的作用。更为重要的是,在体外实验中,未发现苍耳亭明显抑制人正常L02肝细胞的生长,可见苍耳亭抑制肝细胞癌细胞生长的作用具有细胞特异性。结论:苍耳亭对肝癌细胞具有明显的抑制作用,其机制可能与加强内质网应激UPR通路中PERK-eIF2α-ATF4信号通路有关。本研究为将苍耳亭用于肝细胞癌的治疗提供了实验依据,也为寻找更为有效的抗肝癌药物提供了新的思路。