白血病是严重危害人类生命健康的造血系统恶性肿瘤,迄今白血病的治疗仍主要采用传统的大剂量联合化疗,但此疗法副作用大,复发率高,而且对正常机体免疫与造血系统有极大的损害。研究恶性肿瘤尤其是白血病细胞的诱导分化及逆转机制已成为当今生物医学领域内最热点的前沿课题之一。值得注意的是中药以其调节阴阳平衡、注重整体、攻补兼施、毒副作用小、应用范围广泛的优势性得到了广泛认可和重视。从祖国医学宝库中寻找出既能促进正常造血,又能抑制白血病细胞恶性增殖,并诱导其向成熟方向分化的天然诱导分化剂已成为治疗白血病的希望和重要途径。人参(Panax Ginseng)作为祖国传统医学的“补气”要药,已有数千年的临床应用历史,传统的中医学认为人参具有大补元气、补脾益肺、生津止渴、安神益智、补气生血的作用。人参皂甙(Total saponins panax ginseng,TSPG)是人参的主要有效成分之一。近代研究证明,人参皂甙对神经系统、心血管系统、免疫系统都有影响,可以抑制细胞凋亡,抗感染、扩血管、抗衰老、并对运动疲劳的恢复有一定作用。研究还发现,该类化合物在癌症的预防和治疗方面具有较强的活性。随着研究的深入,发现人参的抗肿瘤作用及机制较为广泛:可影响和调节免疫功能,增强机体对疾病的抵抗能力,从而抑制肿瘤的生长;可诱导癌细胞凋亡、抑制肿瘤的生长或诱导癌细胞分化使其逆转;可抑制肿瘤的浸润和转移及肿瘤细胞新生血管的形成;还可逆转肿瘤细胞的耐药性、增强抗癌药的药效。人参皂甙在诱导肿瘤细胞凋亡方面表现为:在人肝癌SK-HEP-1细胞中,人参皂甙作用于凋亡相关蛋白Bcl-2非敏感途径,活化caspase-3蛋白激酶,该酶促使细胞周期相关复合蛋白p21(WAF1/CIP1)裂解并伴有周期素A依赖蛋白激酶CDK2的活化,从而导致细胞发生凋亡。在诱导分化方面表现人参皂甙粗提物可以使体外培养的Morris肝癌细胞在形态和功能方面向正常肝细胞转化。在抑制肿瘤新生血管形成等方面表现为:人参皂甙有抑制B16-BL6黑色素瘤细胞浸润基底膜,抑制肿瘤细胞与纤维粘蛋白和层粘蛋白的黏附及入侵作用,并且能抑制肿瘤周围新生血管的形成。但人参皂甙抗肿瘤作用的具体机制尚未完全阐明。因此,本研究从分子水平上,利用基因表达谱芯片研究人参皂甙对体外培养的人红白血病K562细胞作用后基因表达的改变,通过对芯片探针荧光信号值的数据进行分析,找出人参皂甙作用前后细胞的差异表达基因,然后结合生物学软件研究差异表达基因的不同类别和生物学通路中的具体作用,从而在基因水平上对人参皂甙抗肿瘤的具体作用机制进行研究,为后续的药物临床研究与开发提供实验依据。实验研究分两部分:第一部分:采用光镜、流式细胞仪、细胞内血红蛋白联苯胺染色、透射电镜等方法,观察人参皂甙作用后K562细胞的各种变化。将K562细胞分为两组,对照组为常规培养细胞,处理组在常规培养的细胞中加入不同浓度的人参皂甙。采用MTT法检测人参皂甙对K562细胞的增殖抑制作用,运用血红蛋白联苯胺染色的方法检测人参皂甙对K562细胞的诱导分化作用,用流式细胞仪分别检测两组细胞的表面抗原CD15与CD235ab的表达变化;并先后采用光镜与透射电镜观察两组细胞。MTT比色法检测发现K562细胞增殖抑制程度有随着人参皂甙浓度的增加而增强的趋势;细胞内血红蛋白联苯胺染色检测发现200μg/ml人参皂甙作用3天时细胞的血红蛋白含量最高;流式细胞仪检测结果显示,200μg/ml的人参皂甙作用3天后,K562细胞表面分化抗原CD15与CD235ab表达量均升高,与对照组比较具有显著性差异(P＜0.01),说明200μg/ml的人参皂甙具有诱导K562细胞向红系、粒系方向分化的作用。在光镜下观察发现,对照组与处理组细胞均呈圆形或卵圆形,散在或成簇排列。对照组细胞数量较多,细胞直径介于3-8μm之间;人参皂甙处理组细胞数量相对较少,细胞直径介于2-6μm之间。透射电镜结果显示人参皂甙作用K562细胞后,核仁变小,且电子密度增大,核膜下异染色质增多,胞浆中可见中等电子密度的膜被颗粒,其形态趋于成熟方向分化。可见,人参皂甙能抑制K562细胞增殖,并诱导其向红系、粒系细胞分化,提示人参皂甙有可能成为既能促进正常造血,又能抑制白血病等肿瘤细胞增殖,并诱导其分化的天然药物。第二部分:运用基因芯片技术,检测人参皂甙作用后K562细胞的基因表达谱变化。首先分别提取对照组和人参皂甙组K562细胞的总RNA,采用1%琼脂糖凝胶电泳进行RNA样品的质量鉴定。采用Agilent低RNA荧光线性扩增试剂盒对样品进行双色荧光标记:总RNA逆转录合成cDNA,以Cy3标记对照样品,Cy5标记人参皂甙处理组样品,合成荧光标记的cRNA,并对标记的cRNA进行纯化。纯化后的样品和Agilent Human 1A 60mer寡核苷酸基因芯片进行杂交,杂交完毕后依次用漂洗缓冲液洗涤。然后采用Agilent基因芯片扫描仪扫描,扫描后的数据采用Feature Extraction软件进行数据采集及标准化处理。然后采用Panther数据库对差异表达基因进行生物学功能分析。最后采用半定量RT-PCR对有进一步研究价值且表达改变显著的基因ODZI、FOSL1、CCNE2和LATS1进行验证。在芯片22153个检测点中,发现共同差异表达基因362个,其中20个基因表达上调,主要涉及细胞增殖与分化相关基因,信号转导相关基因,细胞发育相关基因等。表达下调的有342个,主要有免疫防御相关基因,蛋白质合成、代谢与修饰相关基因,细胞周期相关基因等。RT-PCR结果表明,人参皂甙处理后,FOSL1、E2F2和CCNE2表达下调,ODZ1表达上调,与芯片杂交结果一致。人参皂甙作用后K562细胞基因表达谱的变化为:促进分化的基因上调,促进增殖的基因下调,从而使K562细胞的增殖受到抑制并有利于K562细胞的分化。表明人参皂甙对K562细胞有一定的诱导分化和增殖抑制的作用。综上所述,本研究采用人参皂甙作用K562细胞,利用MTT法、光镜、流式细胞仪、细胞内血红蛋白联苯胺染色、透射电镜等手段,观察了K562细胞的变化。研究表明,人参皂甙可以抑制K562细胞的增殖,并诱导部分K562细胞的分化。研究进一步结合基因芯片技术,针对人参皂甙作用后K562细胞的基因表达谱进行研究,通过对差异表达基因的生物学功能予以分类,结合其在代谢通路中的具体作用,从分子水平上对人参皂甙的抗肿瘤机制进行了初步研究和探讨,为人参皂甙进一步应用到肿瘤临床治疗提供了实验依据和研究思路。