论文部分内容阅读
奶牛乳房炎是奶牛养殖业最常见的疾病之一,在规模化、集约化养殖场具有高发病率的特点,给养殖业带来严重经济损失。引起乳房炎的主要致病菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌。其中金黄色葡萄球菌是造成乳房炎最普遍的传染性微生物,这种病原菌定植于乳腺,挤奶工或者挤奶机都有可能使其发生传播。乳房炎的治疗存在常用抗菌药物耐药性严重、药物残留量增加和病情反复等问题,迫切需要研发新的治疗药物。喹赛多是喹噁啉类新兽药,对多种革兰氏阳性和阴性菌敏感性较高,且灌注给药后在奶牛乳腺内的药物浓度远远高于血药浓度。因此开发喹赛多用于治疗奶牛乳房炎有很大意义。乳房灌注剂因其给药方便,靶组织中很快达到较高浓度,能够快速有效的起到治疗作用而成为新的开发热点。本课题拟研制喹赛多乳房灌注剂用于治疗奶牛乳房炎,并在体外和半体内条件下研究了喹赛多对致病性金黄色葡萄球菌的抗菌作用,通过建立半体内PK-PD模型开展该制剂对金黄色葡萄球菌的药动-药效学研究,制定出合理的给药方案,并进行临床药效的验证。1.喹赛多乳房灌注剂的研制通过酸碱中和重结晶和高压均质技术相结合的纳米化技术,按照单因素变量法,在对前期的配方进行优化,以沉降体积比、重分散性、稳定性作为考察指标,筛选助悬剂。最终以1.0 mol/L NaOH溶液为溶媒,2.2%PVP为表面活性剂,0.25%HPMC为助悬剂、15%DMSO为助溶剂,1.0 mol/LHCL溶液为酸碱中和调节剂制备喹赛多乳房灌注剂。本研究对优化后制剂的外观性状、沉降体积比、重分散性、PH、通针性、含量等指标进行评价,利用加速实验和长期稳定性试验对其稳定性进行了考察。结果表明:该制剂为黄色均一的混悬液,规格为10%(100 mL制剂中含有10.0 g喹赛多),久置后底部有很少量的沉淀,沉淀能摇匀;其沉降体积比为1,pH值为7,通针性良好。高温高湿和强光照因素对喹赛多乳房灌注剂的破坏性较大,制剂在4℃条件下避光放置比较稳定。2.喹赛多对牛源金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌的药效学研究采用微量肉汤稀释法测定喹赛多对牛源金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及乳房(无乳、停乳)链球菌的抑菌效果并测定了喹赛多在MH肉汤培养基和牛奶中对金黄色葡萄球菌SAHZ156001的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。根据药敏试验结果,分别配置含有1/2、1、2、4、8、16、32倍MIC浓度喹赛多的MH肉汤进行体外杀菌曲线试验。在奶牛灌注给药喹赛多后不同时间点采集牛奶样品,接种等量金黄色葡萄球菌SAHZ156001,置于恒温培养箱中,于0、1、2、4、6、8、12、24 h涂布平板进行菌落计数,得到半体内杀菌曲线。结果表明喹赛多对金黄色葡萄球菌的MIC普遍分布在8~32 μg/mL之间,对大肠杆菌的MIC在32~64 μg/mL之间,均强于链球菌,对链球菌的MIC普遍高于128μg/mL。说明喹赛多对金黄色葡萄球菌的效果处于中介敏感型。对金葡菌SAHZ156001的体外和半体内抑菌试验结果表明其在MH肉汤中的MIC和MBC分别为16μg/mL和64μg/mL,在牛奶中的MIC和MBC分别为32μg/mL和64μg/mL。体外和半体内杀菌曲线试验结果一致,均为浓度依赖型。3.喹赛多在奶牛乳腺内的药动学研究试验选取6头体重600 kg左右的泌乳期健康奶牛,均按5 mL/乳区(500 mg/乳区)灌注10%喹赛多乳房灌注剂(w/v)。灌注后用手轻轻按摩乳房,使药物均匀扩散。在给药后的1,2,4,6,8,12,24,36,48,72,96 h分别采集5 mL乳汁分装于4 mL离心管中,用高效液相色谱方法(HPLC)测定喹赛多药物浓度。为保证乳房内乳汁循环每天上午和下午均正常挤奶。药动学结果表明灌注给药后,喹赛多在乳腺内很快分布均匀并达到最高浓度,在给药后呈现逐渐消除趋势,至12 h乳汁内药物浓度还高于MBC值,24 h时低于MIC值,于120 h基本检测不到。经过Winnonlin软件非房室模型拟合得到的Cmax为 651.41~854.70 μg/mL,Tmax为 1h,T1/2λz为 0.09~0.10h,AUC 为 3797.8~5087.9μg·h/mL,MRT 为 4.36~6.98 h,CL 为 97.63~130.60 mL/h。4.半体内PK-PD模型拟合利用Sigmoid Emax模型对半体内杀菌曲线中的AUC/MIC值与金黄色葡萄球菌浓度变化对数值进行拟合,计算当E=0、-3和-4时所需要达到的PK/PD参数AUC/MIC值。结合剂量公式Dose=Dtested×AUCex-vivo/MICtested/AUCin-vivo/MICtarge,计算预防、治疗和根除效应的给药剂量。当E分别取0、-3和-4时计算得到对应抑菌、杀菌和根除作用的AUC/MIC值分别为45.05、183.16、338.4 h。根据剂量计算公式,预防、治疗和根除金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎的给药剂量为1.6、6.6、12.2 mL/乳区(160、660、1220 mg/乳区)。基于Mlxplore软件预测结果表明,治疗和根除剂量以24 h为给药间隔连续给药三天能取得预期的治疗效果。5.临床试验试验选取42头体重600 kg左右的泌乳期患病奶牛,经临床分析和病原菌分离鉴定为金黄色葡萄球菌和链球菌混合感染所致,患病牛随机分为头孢喹肟组(6头)、阴性对照组(3头)、喹赛多高中低剂量组(各11头)组。头孢喹肟按说明书给药1支/乳区(150 mg:8 g),一天两次,连续给药三天;喹赛多分别按PK-PD模型拟合出的剂量1.6 mL/乳区(160 mg/乳区)、6.6 mL/乳区(660 mg/乳区)、12.2 mL/乳区(1220 mg/乳区)给药,一天一次,连续给药三天,进行制剂疗效的评价。用药后临床症状均有所好转,红肿消失,中高剂量组乳汁颜色和乳腺温度恢复正常,乳汁中体细胞数明显下降且金黄色葡萄球菌可彻底根除。结果表明该制剂对奶牛乳房炎的治疗效果显著,尤其适用于金葡菌感染引起的乳房炎。