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甘草是我国最常用的大宗药材之一,具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛和调和诸药等作用。由于国务院明令禁止采挖野生甘草,因此中药材市场上的商品甘草为栽培甘草。然而,本课题组前期调查研究表明栽培甘草中甘草酸含量普遍偏低,难以达到《中国药典》规定的最低标准（2.0%）,严重影响了栽培甘草的质量以及含甘草中成药的疗效。甘草酸（Glycyrrhizic acid,GA）是甘草中最为重要的活性成分,也是《中国药典》规定的甘草指标性成分之一,其为五环三萜类化合物,是经由甲羟戍酸（Mevalonic acid,MVA）途径,在众多关键酶的调控作用下合成的。其中,β-香树脂醇合成酶（β-amyrin synthase,β-AS）催化2,3-氧化鲨烯环化生成β-香树脂醇,是形成五环三萜骨架结构的关键酶,也是整条代谢途径中与甘草酸形成直接相关的重要酶。因此,对其编码基因开展研究,分析其基因多态性,有助于阐明甘草酸生物合成的分子机制,为提高栽培甘草的质量提供理论支持。功能基因多态性之所以会导致代谢产物的差异,主要存在两方面原因,一是基因的多态性导致了基因表达水平的差异,另一方面则是基因的多态性导致了其编码酶结构及功能的差异。因此,本论文提出了“功能基因-酶变异是甘草酸形成的分子机制”的假说,拟从功能基因和酶两个层面进行递进式分析。首先分析β-AS基因多态性,筛选甘草酸缺失及高水平积累所对应的特异β-AS基因型,并进一步对其进行基因表达分析以及编码酶体外诱导表达分析,以期全面解析甘草酸形成的分子机制。本论文对于优质甘草药材的分子育种具有重要的理论价值和实践意义,同时对于其他药用植物的同类研究也具有指导意义。本论文采用如下方法开展相应研究工作:利用HPLC法对不同产地的3种基原甘草进行了 18α-甘草酸与18β-甘草酸的含量测定;运用RT-PCR法克隆甘草β-AS基因,并对其多态性进行分析,筛选得到甘草酸高/低含量对应的特异β-AS基因型;利用qRT-PCR对各β-AS基因型进行相对表达量分析;以pPIC9K为载体,构建携带甘草特异β-AS基因型的毕赤酵母GS115酵母工程菌;利用甲醇对其进行诱导表达。本论文取得了以下研究结果:（1）18α-甘草酸与18β-甘草酸的含量测定结果:18β-甘草酸的含量在3种基原甘草样品间均存在显著性差异,其中乌拉尔甘草含量最高,光果甘草次之,而胀果甘草最低;18α-甘草酸含量在乌拉尔甘草与光果甘草间不存在显著性差异,而在乌拉尔甘草与胀果甘草、光果甘草与胀果甘草间均存在显著性差异,其中乌拉尔甘草18cα-甘草酸含量最高,光果甘草次之,而胀果甘草最低。此外,相关性分析结果显示,所有甘草样品中18α-甘草酸与18β-甘草酸含量之间均存在相关关系。根据以上含量测定结果确定了 18α-甘草酸缺失组、18α-甘草酸高含量组、18β-甘草酸低含量组、18β-甘草酸高含量组,对各组甘草样品进行进一步的β-AS基因多态性分析。（2）β-AS基因多态性分析结果:扩增得到13条甘草β-AS基因cDNA序列,共计11种单倍型,编码5种氨基酸序列类型。甘草β-AS基因编码区全长2289 bp,共编码762个氨基酸残基。18α-甘草酸缺失组及18β-甘草酸低含量组甘草样品在104 bp（G-C）及106 bp（G-C）均存在特异变异位点,分别导致氨基酸序列中35位上丝氨酸-苏氨酸（S-T）转变以及36位上丙氨酸-脯氨酸（A-P）转变,其中35-T+36-P为18α-甘草酸缺失组及18β-甘草酸低含量组所对应的特异β-AS氨基酸序列变异类型,而35-S+36-A则为18α-甘草酸高含量组及18β-甘草酸高含量组所对应的特异β-AS氨基酸序列变异类型。（3）β-AS基因相对表达量分析结果:在甘草不同样品间β-AS基因表达水平差异显著,就整体而言,18α-甘草酸高含量组甘草样品的β-AS基因相对表达水平要高于18α-甘草酸缺失组甘草样品,18β-甘草酸高含量组甘草样品的β-AS基因相对表达水平要高于18β-甘草酸低含量组甘草样品。从而说明18α-甘草酸与18β-甘草酸的高水平积累与β-AS基因的高水平表达具有正相关关系。（4）特异性β-AS基因毕赤酵母工程菌构建及表达分析:以pPIC9K为载体,构建了携带甘草特异性β-AS基因型的毕赤酵母 GS115 工程菌GS115-pPIC9K-BAS-3和GS115-pPIC9K-BAS-8,对其进行His+转化子筛选、遗传霉素G418筛选、Mut+型重组子筛选、PCR验证及测序验证,利用甲醇对验证正确的工程菌进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳进行检测,得到与甘草β-AS酶蛋白大小一致（87kDa）的产物,即诱导表达成功。本论文为解析甘草酸生物合成的分子机制、提高栽培甘草的质量奠定了基础,也为甘草的优质基因筛选以及分子育种提供了理论依据。