美伐他汀(mevastatin又称为compactin或ML-236B)是由桔青霉Penicillium citrinum产生的一种聚酮类化合物,它是HMG-CoA还原酶的有效的竞争性抑制,从而抑制胆固醇的生物合成。美伐他汀他通常作为微生物转化的底物,进一步合成普伐他汀(pravastatin),普伐他汀已经广泛用于治疗高胆固醇血症。美伐他汀生物合成基因簇已经被鉴定,受到途径特异性转录激活因子mlcR的正调控。但是,在桔青霉中,还没有发现控制美伐他汀生物合成的全局性调控因子。在丝状真菌中,LaeA是一个重要的次级代谢全局性调控因子,它是在构巢曲霉中首次被发现的新的全局性调控因子,调控多个次级代谢基因簇的表达及其次级代谢物的产生,例如sterigmatocysin、aflatoxin、lovastatin、penicillin、gliotoxin等。在丝状真菌中具有广泛存在性和其功能的保守性,其可能成为一个通用的基因工程靶标,应用于其他重要真菌的菌株改良或疾病防治。因此,确定LaeA在mevastatin产生菌P. citrinum次级代谢中的作用具有重要意义。在本实验中,我们从一株美伐他汀产生菌桔青霉中分离鉴定laeA同源基因Pci-laeA。首先,根据已报道的LaeA蛋白,我们设计合成laeA基因简并引物,通过RT-PCR扩增了约780bp的cDNA片段,该片段是laeA基因的同源性片段。根据获得的同源性片段,我们设计并合成了3个基因特异性的正向引物F1、F2、F3和3个基因特异性的反向引物R1、R2、R3。利用3个正向引物,通过cDNA末端快速扩增技术(3’RACE),我们克隆得到了Pci-laeA基因cDNA 3’末端序列1136bp,其3′末端含有一个poly (A) 34序列；其5′端序列与上述获得的laeA基因同源性片段3′端序列重叠,重叠序列长度与预测的一致,为387bp。利用3个反向基因特异性引物R1-3,通过TAIL-PCR技术,我们获得了Pci-laeA DNA的5端序列991个碱基,其3′端与上述获得的laeA基因同源性片段5′端序列重叠,重叠序列长度与预期的一致,为177bp。使用DNAstar软件的SeqMan程序将上述克隆的Pci-laeA基因的同源性片段、3’末端和5’末端序列拼接成完整的DNA序列,确定其完整的开放阅读框。设计合成特异性引物：LAF1和LAR1,用于PCR扩增Pci-laeA基因全长DNA和cDNA序列,该基因DNA序列含有一个1340bp的开放阅读框,cDNA序列全长为1284bp,编码427个氨基酸。DNA与cDNA序列比对显示pci-laeA含有一个56bp的内含子。采用半定量RT-PCR法确定Pci-laeA基因在桔青霉不同生长阶段的差异表达。首先,进行半定量RT-PCR条件优化：内标基因pgk(磷酸甘油酸激酶)和Pci-laeA的最佳PCR循环数分别为28、34个循环作。半定量RT-PCR分析Pci-laeA基因在发酵初期(24h)、中期(96h)和后期(120h,168h)的表达量,结果显示,它在细胞中的表达是组成型的,但是发酵后期表达量要高于发酵初期,这与美伐他汀的生物合成量的变化有一致性。次级代谢全局性调控因子Pci-laeA的发现为深入研究美伐他汀生物合成的分子调控机制和菌种改良奠定了基础。