论文部分内容阅读
新生儿缺血缺氧性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage HIBD)是造成儿童神经系统伤残的主要原因之一,病理学证实其主要病变是少突胶质细胞尤其是少突胶质前体细胞以及髓鞘的病变而引起的脑白质损伤。Neuregulin 1(NRG1)是一种细胞间信号转导蛋白,在脑组织内由神经胶质细胞和神经元产生。它能促进少突胶质细胞存活、迁移、增殖和分化,也可以促进髓鞘形成。NRG1在缺氧诱导的少突胶质前体细胞损伤中是否有保护作用?是否能促进因缺氧而引起的脑白质损伤的修复?为了探讨这些问题,本实验通过体外体内两部分四个分题进行研究。论文1:少突胶质细胞原代纯化培养及细胞体外缺氧模型建立目的纯化培养大鼠大脑皮层O2A细胞,观察其形态,并研究不同培养条件对其生长和分化的影响;以及建立体外O2A细胞缺氧培养模型。方法采用两次恒温摇床振荡培养法,倒置显微镜结合免疫荧光染色法鉴定细胞种类并判断纯度,缺氧联合低糖培养建立细胞体外缺氧模型,透射电镜观察细胞超微结构,台盼蓝染色计数细胞存活率,流式细胞仪定量分析细胞凋亡情况。结果O2A祖细胞胞体呈圆形,常有单极或双极突起,形成克隆球,A2B5标记阳性,免疫荧光鉴定细胞纯度可达90%以上。生长因子PDGF和bFGF对O2A细胞的存活和增殖及其重要。O2A细胞具有双向分化的能力,在不同诱导条件下可分化为星型胶质细胞或少突胶质细胞。电镜观察O2A祖细胞呈圆形或椭圆形,核仁可见,胞浆内细胞器少,核周见成束胞质丝。缺氧培养3h细胞变化不明显,但缺氧培养6h,细胞存活率明显下降(P<0.01),凋亡细胞明显增多(P<0.01),并且随着缺氧时间延长存活细胞更少,凋亡细胞更多,至缺氧培养12h,大多数细胞破碎。结论1.选择合适的培养基对O2A细胞纯化培养及诱导分化极其重要。2.低糖联合缺氧培养模式可以建立可行的O2A细胞体外缺氧模型。论文2: NRGβ1对缺氧培养O2A细胞保护作用及PI3K-Akt信号通路在其中的调控作用目的研究NRGβ1对缺氧培养O2A细胞损伤的保护作用,并探讨其主要的细胞内信号转导机制。方法原代纯化的O2A细胞分为缺氧联合低糖培养组和NRGβ1干预组,NRGβ1干预组指在缺氧培养之前在培养液中加入两种浓度的NRGβ1。台盼蓝染色计数细胞存活率,Hoechest33258染色和流式细胞仪观测细胞凋亡情况,western blot法测定Akt和p-Akt蛋白的表达并定量分析。结果NRGβ1干预组O2A细胞存活率高于缺氧培养组(P<0.05或P<0.01),且凋亡的O2A细胞减少(P<0.05或P<0.01),NRGβ1对细胞的保护呈剂量依赖性。NRGβ1可以上调因缺氧培养而降低的p-Akt的表达,但该作用被Ly294002所阻断。结论NRGβ1对缺氧培养的O2A细胞有保护作用,且该作用可能与PI3K依赖的p-Akt信号转导通路激活有关。论文3. 3日龄新生鼠脑白质损伤模型建立及超微病理学研究目的建立新生鼠脑白质损伤的动物实验模型,并研究其胶质细胞和髓鞘的超微结构变化。方法80只3日龄(P3)SD大鼠随机分为假手术组(sham)和缺血缺氧(HI)组,每组各40只。sham组仅分离右侧颈总动脉,HI组行右侧颈总动脉结扎术,术后吸6%氧气-94%氮气混合气体3h,建立P3大鼠缺血缺氧模型。观察两组大鼠(每组n=20)生理和神经学行为包括体重变化,睁眼时间,悬崖逃避能力,双臂悬吊能力。取P14,P21大鼠脑组织各10只进行常规病理HE染色,免疫组化染色以及电镜观察胶质细胞和髓鞘的变化。结果HI组大鼠生长缓慢,睁眼时间延迟,悬崖逃避能力及双臂悬吊能力均发育缓慢,有统计学意义。HE染色见60%(6/10)P14及50% (5/10) P21大鼠脑室周围白质及(或)胼胝体纤维排列紊乱,疏松。MBP免疫组化染色发现HI组颈动脉结扎侧脑组织MBP表达减少,电镜观察见HI组少突胶质细胞可同时出现凋亡和肿胀性死亡两种改变,髓鞘呈虫蚀样改变,髓鞘厚度变薄(P<0.05)。结论P3大鼠单侧颈总动脉结扎联合低氧实验可以建立脑白质损伤的动物模型。少突胶质细胞可发生凋亡和胀亡两种病变,髓鞘合成减少和异常合成可能并存。论文4: NRGβ1对脑白质损伤模型新生鼠的保护作用目的:探讨NRGβ1对新生鼠脑白质损伤的保护作用。方法: P3大鼠随机分成假手术组(sham, n=40),缺氧缺血组(HI, n=40),和NRGβ1治疗组(NRGβ1,n=40)。sham组仅分离右侧颈总动脉;HI组行右侧颈总动脉结扎术,恢复1～1.5h后脑室内注射2ul无菌生理盐水再放置于含6%氧气-94%氮气混合气体的容器中3h;NRGβ1组行右侧颈总动脉结扎术,恢复1～1.5h后脑室内注射2ul无菌NRGβ1后再放置于含6%氧气-94%氮气混合气体的容器中3h。观察各组大鼠生长发育和神经学行为变化(n=20)包括体重变化,睁眼时间,悬崖回避反应时间,双臂悬挂时间。取各组P7,P14和P21大鼠脑室周围白质(n=5,每个日龄),应用Western blot法比较分析各组大鼠脑室周围白质髓鞘碱性蛋白(MBP)合成情况。取各组P21大鼠(n=5)脑室周围白质和胼胝体组织常规电镜标本处理后透射电镜观察胶质细胞和髓鞘的变化。结果:NRGβ1组大鼠脑室周围白质中少突胶质细胞病变与HI组相比较有所减轻,肿胀性死亡和凋亡的少突胶质细胞减少,胼胝体超微结构观察髓鞘病变减轻,髓鞘厚度定量分析发现髓鞘的厚度也有所增厚(P<0.05)。Western blot检测P7、P14、P21大鼠脑室周围白质MBP表达发现各组大鼠随着生长,MBP表达逐步增加。与sham组相比,HI组相应日龄大鼠脑白质MBP的表达明显减少(P<0.01),而NRGβ1组相应日龄者MBP的表达与sham组相比均有恢复(P<0.05)。生理发育和神经行为观察发现与HI组比较,NRGβ1组大鼠生长发育得以改善(体重增加,睁眼时间提早),悬崖回避反应时间也缩短(P<0.05),但双臂悬挂能力无明显改善。结论:NRGβ1可以减轻HI引起的少突胶质细胞的病变,促进髓鞘合成,并使大鼠部分神经行为功能得以不同程度恢复。