论文部分内容阅读
本研究利用Red同源重组技术从分子水平对常用大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)进行了改良——①使E.coil BL21(DE3)的lpxM基因发生插入失活，构建了lpxM突变菌株；②在lpxM位点敲入带有OmpA信号肽的金黄色葡萄球菌核酸酶基因，构建了破菌时可自动降解宿主核酸的菌株。以期方便、有效地降低所表达重组蛋白的内毒素污染、核酸污染，以及降低因宿主菌染色体核酸释放导致的破菌液的黏度，为产品纯化和质量提高打下基础。 1、lpxM基因失活可以产生极低内毒素活性的脂多糖。构建同源臂500bp左右的打靶载体，借助Red同源重组系统，使E.coli BL21(DE3)的lpxM基因发生插入失活，再导入编码FLP位点特异性重组酶的质粒pCP20去除抗性基因。通过PCR鉴定发生插入突变的菌株，应用SDS-PAGE分析突变前后的脂多糖以及考查对重组蛋白表达的影响。PCR鉴定结果说明lpxM基因发生了插入突变。与出发株比较，突变株的脂多糖电泳图谱发生了明显变化，但其生长状态与表达重组蛋白的能力与出发株基本一致。为后续敲入外源功能基因，改造E.coli BL21(DE3)提供一个可行、方便的靶位点，同时该突变株生产的药用重组蛋白，引发内毒素反应的可能性大大降低。 2、构建破菌时可自动降解宿主核酸的大肠杆菌表达宿主菌，高效、廉价地解决因宿主菌染色体核酸释放导致裂解液高粘度给后续纯化重组蛋白工作带来的困难，并减轻重组蛋白终产品中的核酸污染。在已证实lpxM基因失活对E.coli BL21(DE3)生长状态与表达重组蛋白的能力没有影响的基础上，将N端连有ompA的信号肽的S.aureus nucleaseB(nucB)表达框整合至lpxM位点，所表达产物可转运至周质空间。改造后菌株——BLN经诱导能表达nucB、并存于周质空间，菌体裂解后能自动降解宿主核酸，降低裂解液黏度。与出发菌比较，其菌体生长状态以及表达外源重组蛋白的能力不受影响。