第一部分 血清性激素和GAS6水平与男性冠心病发病风险的相关性研究研究背景与目的:流行病学研究发现,男性心血管病患者血清睾酮水平明显降低。酪氨酸激酶受体Axl广泛表达于血管系统,其特异性配体为生长抑制特异蛋白6(Growth arrest-specifc protein 6,GAS6),研究显示血清GAS6水平与内皮细胞功能紊乱和心血管事件的发生相关。睾酮和雌二醇可以调节GAS6基因的转录,发挥心血管保护功能。性激素水平降低,从而引起血清GAS6水平降低,提示GAS6可能是冠心病发生的危险因素。因此,本部分旨在研究男性冠心病患者体内性激素和GAS6的水平变化,并深入分析性激素、GAS6与冠心病危险因子的相关关系。研究方法:选取武汉大学人民医院心内科男性冠心病患者327例为研究对象,根据冠脉造影结果分为疾病组225例(CHD组),对照组102例(Control组)。ELISA法检测血清GAS6水平,免疫电化学发光检测血清睾酮和雌二醇水平,全自动生化分析仪检测血清血脂、超敏C反应蛋白及其他生化相关指标。统计分析各指标之间的相关性以及与冠心病之间关系。研究结果:健康对照组血清睾酮水平为432.69±14.40ng/dl,冠心病组血清睾酮水平下降至300.76±6.23ng/dl,雄雌激素比例(T/E2 ratio)从12.96下降至9.83;健康对照组GAS6水平为16.20±0.31ng/ml,冠心病组GAS6水平下降至12.51±0.19ng/ml。Spearman相关性分析结果显示冠心病患者血清GAS6水平与血清睾酮、T/E2 ratio、hs-CRP等呈正相关(P<0.05);Logistic回归分析结果显示血清睾酮、GAS6是冠心病的独立危险因素(P<0.01);多重线性回归分析结果显示血清GAS6水平与睾酮成线性关系(β-coefficient=0.511,P<0.001)。研究结论:本研究证实了男性冠心病患者血清睾酮、T/E2 ratio和GAS6水平显著下降。血清GAS6水平与睾酮成正相关。线性回归分析发现GAS6水平与睾酮成线性关系,表明血清睾酮水平的降低引起GAS6水平下降,从而降低GAS6/Axl信号通路的保护作用。GAS6/Axl信号通路与内皮细胞功能紊乱相关,睾酮可能通过影响GAS6/Axl信号通路在动脉粥样硬化形成过程中发挥重要作用。第二部分雌雄激素协同作用增强内皮细胞GAS6/Axl信号及其抗细胞凋亡的机制研究研究背景与目的:生长抑制特异蛋白 6(Growth arrest-specific protein 6,GAS6)是维生素 K依赖蛋白分子,与其特异性酪氨酸激酶受体Axl结合,激活GAS6/Axl信号通路,参与调控血管内皮细胞、血管平滑肌等细胞的增殖、分化、粘附以及炎症等。在冠心病血清学水平研究证实,男性冠心病患者血清睾酮和GAS6水平显著降低,与冠心病的发生有关。血管内皮细胞损伤是动脉粥样硬化发生的初始启动因素,GAS6/Axl信号通路在维护血管内皮细胞功能方面发挥重要的调节作用。正常人体内的雄激素和雌激素处在正常的浓度水平和比例,以维持正常的生理功能。有研究报道,性激素(睾酮和雌二醇)调控GAS6基因转录,进而激活GAS6/Axl信号通路发挥内皮细胞保护作用。然而,不同比例的雄雌激素在激活GAS6/Axl信号通路发挥内皮细胞保护作用还不甚清楚。本部分以人脐静脉内皮细胞(HUVECs)为模型,研究不同雄雌激素比例诱导GAS6表达情况,探索诱导GAS6表达的最适雄雌比例,并进一步利用炎性因子TNF-α刺激HUVECs诱导炎症模型,深入研究最适雄雌比例诱导GAS6表达,激活GAS6/Axl信号通路对HUVECs炎症修复及抗凋亡作用的保护机制。研究方法:以HUVECs为细胞模型,用不同比例的雄雌激素诱导GAS6表达,Western blot检测GAS6蛋白表达;用TNF-α(l0ng/ml)刺激HUVECs诱导炎症模型,观察最适雄雌激素比例对HUVECs炎症的修复及其抗凋亡的保护作用。采用流式细胞术检测内皮细胞活性氧的产生以及凋亡细胞比例;Western blot检测GAS6、VCAM-1、ABCG1、凋亡相关蛋白以及PI3K/Akt信号通路蛋白。研究结果:当睾酮(20×10-8mol/L)联合雌二醇(1×10-8mol/L)作用即睾酮/雌二醇比例为20:1时,诱导HUVECs表达的GAS6表达水平最高;同时,睾酮/雌二醇诱导GAS6表达可被雄激素受体抑制剂(氟他米特)/雌激素受体抑制剂(氟维司群)所抑制。流式细胞术检测结果显示,睾酮/雌二醇比例为20:1时,HUVECs活性氧(ROS)和凋亡细胞数明显低于TNF-α诱导组,且明显优于单纯睾酮组。Western blot检测结果显示,TNF-α刺激组凋亡蛋白Bax升高,抗凋亡蛋白Bcl-2显著降低,加入睾酮(20×10-8mol/L)和雌二醇(1×10-8mol/L)后,凋亡蛋白Bax显著降低,抗凋亡蛋白Bcl-2升高,且修复作用明显优于单纯睾酮组。TNF-α诱导可使HUVECs合成ABCG1显著降低,而VCAM-1显著升高,当给予睾酮(20×10-8mol/L)和雌二醇(1×10-8mol/L)后,ABCG1 显著升高,VCAM-1 显著降低,且效果明显优于单纯睾酮组。睾酮和雌二醇组GAS6表达水平明显高于单纯睾酮组;Axl的磷酸化水平显著升高,同时信号通路蛋白PI3K和Akt的磷酸水平也显著升高。研究结论:本研究结果显示,睾酮(20×10-8mol/L)联合雌二醇(1×10-8mol/L)时诱导GAS6表达,激活GAS6/Axl信号通路抵抗TNF-α诱导HUVECs产生ROS和内皮细胞凋亡,VCAM-1表达降低,ABCG1水平升高,保护,TNF-α诱导的内皮细胞损伤,其对内皮细胞的保护效应和抗凋亡作用明显优于单纯睾酮组,同时细胞信号通路蛋白PI3K、Akt磷酸化水平增高。研究证实了睾酮联合雌二醇协同作用诱导GAS6表达,使特异性受体Axl磷酸化,进而激活PI3K/Akt信号通路发挥抗内皮细胞凋亡的作用。第三部分雌雄激素协同作用诱导ApoE-/-小鼠GAS6表达抗动脉粥样硬化的保护作用研究背景与目的:雄激素替代治疗(TRT)用来预防男性冠心病,曾因其严重的不良反应一度被迫终止使用,但近年有研究表明雌激素具有心血管保护功能,且具有较强的抗炎和抵抗雄激素的一些不良反应。正常人体内同时存在一定浓度的雄激素和雌激素,雄雌激素处于一个动态平衡状态,维持机体正常的生理功能。GAS6是维生素K依赖的蛋白分子,与其特异性受体(Axl)组成的GAS6/Axl信号通路在维护血管内皮细胞的正常生理功能方面发挥重要作用。研究发现在GAS6基因的启动子区域有性激素(睾酮、雌二醇)反应原件,睾酮和雌二醇能启动GAS6基因转录,表明体内的雄激素和雌激素可能通过调控GAS6蛋白表达,激活GAS6/Axl信号通路维持机体正常生理功能前期研究发现男性冠心病患者血清睾酮和GAS6水平显著降低,进而引起GAS6/Axl信号通路的减弱是冠心病发病的危险因素,同时在HUVECs模型中也发现雌雄激素协同作用诱导GAS6表达抑制ROS和凋亡蛋白的产生,发挥抗炎和抗内皮细胞凋亡作用。本部分研究采用去势雄性ApoE-/-小鼠构建性激素缺乏的动脉粥样硬化模型,深入研究雌雄激素联合给药后,小鼠体内GAS6水平的表达以及抗动脉粥样硬化的保护效应,为动脉粥样硬化相关疾病的预防或治疗提供新策略。研究方法:将8周龄的雄性ApoE-/-小鼠随机分为对照组(n=10)和实验组(n=30),将实验组小鼠睾丸切除,建立性激素缺乏的动脉粥样硬化小鼠模型。实验分为4组:对照组、模型组、单纯睾酮组(19μg/d)、雌雄激素联合组(1μg/d雌二醇+19μg/d睾酮)。连续喂养120天后,采集小鼠血液,颈椎脱臼法处死小鼠后取材,油红O染色分析小鼠主动脉和主动脉瓣粥样斑块,免疫荧光分析主动脉瓣细胞成分以及主动脉平滑肌增生情况,全自动生化分析仪器检测小鼠血清脂质水平,ELISA检测血清GAS6、炎性细胞因子TNF-a、IL-6、抗炎细胞因子IL-10水平。研究结果:与对照组比较,模型组小鼠整体主动脉的粥样斑块较多,斑块内脂质沉积和巨噬细胞浸润增多,主动脉平滑肌增殖明显,同时主动脉粥样斑块GAS6表达下降。血清检测方面,与对照组比较,模型组小鼠TC、TG、LDL-C水平升高(P<0.05),而 HDL-C 显著降低(P<0.05),炎性因子 IL-6、TNF-α升高(P<0.05),抗炎因子IL-10与GAS6降低(P<0.05)。雌雄激素联合给药时,与模型组相比,整体主动脉斑块数明显减少,主动脉瓣斑块脂质沉着减少及巨噬细胞浸润减少,主动脉斑块GAS6表达增加,主动脉平滑肌细胞增殖减弱,血清TC、TG、LDL-C降低(P<0.05),HDL-C显著升高(P<0.05),炎性因子IL-6、TNF-α降低(P<0.05),抗炎因子 IL-10 与 GAS6 升高(P<0.05)。研究结论:雌雄激素联合治疗的去势小鼠整体主动脉粥样斑块显著减少,主动脉瓣脂质沉积及巨噬细胞浸润减少,减少泡沫细胞的形成、抑制内皮细胞损伤和血管平滑肌细胞增殖。同时,雌雄激素联合治疗后血清炎性因子IL-6、TNF-α降低,抗炎因子IL-10以及GAS6显著升高,血清TG、TC、LDL-C降低,HDL-C升高。结果表明雌雄激素协同作用可能通过调控GAS6表达,激活GAS6/Axl信号通路降低血清炎性因子浓度、提升抗炎因子浓度,从而抑制动脉粥样硬化的发展。因此,动物实验进一步证实了雌雄激素联合治疗可能通过增强GAS6/Axl信号通路可以有效抑制动脉粥样硬化发生发展,为雌雄激素联合治疗动脉粥样硬化相关疾病提供了理论依据。