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背景及目的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）是医院获得性感染的常见致病菌,常表现为多重耐药甚至是泛耐药,临床上抗生素治疗选择也受到极大限制,导致发病率和死亡率的增加。碳青霉烯类抗生素的广泛使用及滥用致使CRKP的检出率逐年上升。目前,CRKP已经在全球范围内传播,关于医院CRKP感染暴发的报道也在逐渐增多。CRKP的广泛播散已成为全世界关注的重要公共卫生问题,其在环境中的流行和传播更需要引起高度重视。污水处理厂汇集社区、医院、企业等多方面的污水,含有大量耐药菌（ARB）和耐药基因（ARGs）。虽然污水处理厂在去除常规污染物（氨、磷酸盐等）方面非常有效,但在去除各种药物（包括抗生素）和其它化合物方面的能力非常有限,污水处理厂出水中仍然具有一定的细菌负荷量。污水处理厂污水排放与污泥土地利用等方式是向环境中释放和扩散ARB及ARGs的重要渠道。因此,污水处理厂中ARB和ARGs的存在与人类公共健康休戚相关,也是国内外的研究热点。既往研究表明污水处理厂处理工艺可以影响ARB的分布和浓度。但仅有少数研究调查了污水处理各处理工艺中ARB的分布及变化情况。大多数研究仅集中于入水和出水中ARB浓度的对比分析,且研究结果仍存在争议。另外,季节变化可影响污水处理厂ARB的来源和生长繁殖,进而影响ARB的分布与浓度。因此,结合各功能区域及季节变化因素的动态研究有利于了解ARB在污水处理厂中赋存情况。目前关于污水处理厂中ARB的研究多以耐药的异养细菌、大肠菌群、大肠杆菌等为调查对象,缺少关于CRKP在不同功能区域、不同季节中分布的相关研究。此外,医院及污水处理厂是向环境传播ARB的重要媒介,医院和污水处理厂中CRKP的自身特征和流行状况与环境CRKP密切相关。为了有效预防和控制CRKP在环境中的传播,我们需要明确污水处理厂中CRKP的特征及其与临床菌株的关系。因此,本研究的目的是掌握中国济南市某大型污水处理厂中CRKP的耐药特征、毒力特征、分子流行病学特征;探究不同处理工艺和季节中CRKP的赋存特征;探讨污水处理厂中检出的临床重要CRKP与医院感染相关CRKP的关系。方法分别于2018年冬季（1-2月）、春季（5月）、夏季（8月）、秋季（11月）采集济南市一座污水处理厂内不同功能区域样本（污水、污泥及泥饼）。每个季度进行两次采样,2019年1月额外进行1次采样。使用添加2μg/mL美罗培南的麦康凯培养基对样本进行耐碳青霉烯类革兰氏阴性杆菌的筛选。使用PCR和sanger测序技术对碳青霉烯类ARGs包括blaNDM、blaKPC、blaVIM、blaIMP和blaOXA-48进行检测,结合菌株鉴定结果确定CRKP。通过抗菌药物敏感性试验（AST）确定菌株的耐药表型。采用Sl-PFGE和Southern blot确定碳青霉烯类ARGs是否位于质粒上以及所在质粒的大小。利用SPSS对不同功能单位、不同采样季节、日内不同采样时点的CRKP检出率间的差异,以及环境气温与CRKP检出率间的关系进行统计分析。应用Illumina NovaSeq 6000-PE150平台对分离的CRKP菌株进行全基因组测序,分析CRKP的耐药基因型、多位点序列分型（MLST）、质粒、荚膜血清分型、毒力基因以及菌株间的遗传关系进行研究。结果1.从污水处理厂中共分离49株CRKP。检出的CRKP具有不同的MLST分型,以 ST11 型（n=31）为主,其次是 ST766（n=4）,ST15（n=2）,ST220（n=2）,ST22,ST45,ST364,ST414,ST1999,ST2158,ST4584。所有 CRKP 均携带碳青霉烯类ARGs lbaKPC-2和/或blaNDM、一个或多个β-内酰胺类ARGs（blacTx-M、blaTEM-1B、blaSHV、blaCMY-6、blaOXA-1、blaLAP-2、blaOKP）及磷霉素抗性基因fosA,并对多种抗生素表现出高水平耐药性。耐药质粒分析结果显示ST11型CRKP主要携带blaKPC-2阳性的IncFII-IncR质粒,大小为～90kb至～238kb,部分质粒与在医院中检出的多重耐药质粒pKPC-CR-hvKP-C789具有较高的基因组覆盖率和核苷酸一致性。ST766型CRKP均携带blaNDM阳性的IncX3型质粒,大小为～46kb,与在国内外广泛报道的IncX3质粒具有较高的基因组覆盖率和核苷酸一致性。2.共鉴定出10种血清荚膜分型,以ST11-KL64-wzi64型（n=25）为主,其次为ST11-KL47-wzi209（n=3）,KL19-wzi19（n=2）,KL15-wzi50,KL24-wzi101,KL9-wzi9,KL28-wzi84,KL114-wzi354,KL116-wzi180 及 KL123-wzi44。所有 CRKP 均携带一种或多种毒力因子编码基因,包括编码铁载体（气杆菌素,肠杆菌素,耶尔森菌素）、菌毛（Ⅰ型和Ⅲ型菌毛）和荚膜的相关毒力基因。毒力质粒分析发现部分产KPC-2的ST11型CRKP携带具有毒力基因簇rmpA2-iucABCD-iutA的IncHI1 B/IncFIB（K）型毒力质粒。此型毒力质粒与高毒力质粒pVir-CR-hvKP-C789、pVir-CR-HvKP4等具有较高的基因组覆盖度和核苷酸一致性。3.2018年不同功能区域CRKP检出率分别为入水口（41.7%,10/24）,厌氧池（16.7%,4/24）、生物好氧池（8.3%,2/24）、活性污泥池（12.5%,3/24）、污泥浓缩池（20.8%,5/24）、泥饼堆放区（0.0%,0/24）、出水口（25.0%,6/24）,差异具有统计学意义（P＜0.05）。其中入水口的CRKP检出率高于生物好氧池、活性污泥池及泥饼堆放区;厌氧池、污泥浓缩池、出水口的CRKP检出率高于泥饼堆放区（P＜0.05）。2018年不同采样季节CRKP检出率分别为夏季（28.6%,12/42）、春季和秋季（16.7%,7/42）、冬季（9.5%,4/42）,差异无统计学意义（P＞0.05）。线性趋势卡方检验结果显示,-10℃至40℃范围内,CRKP检出率有随温度增加而增高的线性趋势（P＜0.05）。日内不同采样时间点间CRKP检出率差异无统计学意义（P＞0.05）。2019年1月CRKP检出率为（52.4%,11/21）。4.基于核心基因组多位点序列分型（cgMLST）分析生成的最小生成树（MST）结果显示污水处理厂来源的ST11-KL64和ST11-KL47型CRKP菌株与医院患者感染的同型CRKP菌株构成克隆簇。医院中ST11-KL64和ST11-KL47型CRKP菌株的检出与污水处理厂中克隆株的检出具有时间关联。另外,污水处理厂来源的CRKP也具有ST766、ST220、ST15型克隆簇。单核苷酸多态性（SNP）差异分析显示ST11型CRKP克隆簇的菌株间SNP差异较少,其中大部分ST11-KL64 CRKP菌株与已报道的耐碳青霉烯类高毒力K.pneumoniae C789菌株间也具有较少SNP差异。BLASTn对比显示这些菌株与C789具有较高的基因组覆盖率和核苷酸一致性。结论1.本研究污水处理厂检出的CRKP存在多种耐药基因共存现象,具有多重耐药性及较高毒力潜力。2.污水处理厂对CRKP去除具有一定效果,但最终出水中仍检出多重耐药及高毒力的CRKP菌株。污水处理厂亟需加强出水前的污水消毒力度,优化废水消毒技术;环境气温对CRKP的检出具有一定的影响,CRKP的流行与季节的关系有待进一步研究。2019年冬季CRKP的高检出率可能与流感暴发有关;本研究证明了“高风险”ST11-KL64及ST11-KL47型CRKP在污水处理厂、医院以及两者之间的流行与传播,医院污水很可能是污水处理厂中CRKP污染的重要来源。医院迫切需要采取有效措施遏制此类“超级细菌”的感染与扩散,着重加强医院污水消毒力度。