论文部分内容阅读
目的: α-地中海贫血（alpha-thalassemia）是一种常见的常染色体隐性遗传病，该病的发生主要由编码α珠蛋白的α基因（α1和α2）缺失引起。而目前对于该疾病的诊断主要依赖于基因分析，但常用的多重Gap-PCR检测方法通常仅限于几种常见的缺失型α-地贫基因，对于部分罕见及未知的缺失型α-地贫基因无从检测。本研究旨在建立一种能同时检测常见与罕见甚至未知缺失型α-地中海贫血的多重PCR结合荧光片段分析（Quantitative Multiplex PCR of Short Fluorescent FragmentsAnalysis，QMPSF）方法，并探讨该方法用于检测缺失型α-地贫基因的可行性。方法:1．根据荧光片段分析技术原理，选取50例无α基因缺失的健康对照者、50例α基因杂合缺失的α-地贫患者、50例α基因纯合缺失的α-地贫患者基因组DNA，建立应用多重定量PCR结合荧光片段分析的检测α-基因缺失的方法，α基因的拷贝数（Rα）通过样本内与样本间的两次标准化计算而获得。2．应用建立的QMPSF方法检测579例广东和广西籍患者样本，同时利用多重Gap-PCR（检测中国人群中常见的--SEA、-α3.7与-α4.2地贫基因）进行平行检测。比较两方法结果，结果不吻合者进一步通过多重连接酶依赖的探针扩增技术（MLPA）以及后续的实验检测。结果:1.所建立的方法能准确的检测缺失型α-地贫基因，各类样本的α基因（包括α1和α2）拷贝数（Rα）均值（SD，区间）分别为：阴性对照1.00（0.14，0.77-1.31）；α1或α2基因杂合缺失者为0.60（0.07，0.40-0.75）；α1或α2基因纯合缺失者为0.00（0.00，00.0-0.00）。2.QMPSF与多重Gap-PCR对579例样本进行平行检测结果显示：：572例样本结果吻合，7例样本结果不符合。这7例样本最终通过MLPA及后续实验证明由1例罕见缺失型--THAI/-α3.7，1例新缺失型--SEA/-α2.8，4例αααa n t i3.7，1例αααa n t i4.2组成。对于此7例样本应用建立的方法检测结果与MLPA结果一致。结论：本文所建立的多重PCR结合荧光片段分析方法应用于α-珠蛋白基因的缺失检测，是一种准确性高、重复性好的方法，能用于常见与罕见甚至未知缺失型α-地贫基因以及α-珠蛋白基因重复突变的检测，它能提高地中海贫血携带者的检出率，可作为目前针对α-地贫的基因检测仅限于几种常见缺失型现状的很好补充。