研究背景肾癌是泌尿系最常常见恶性肿瘤之一,其发病率约为全身恶性肿瘤的2%-3%,其中80%以上为源于肾近曲小管的肾透明细胞癌,并且以每年2%的速度递增。目前肾癌的主要治疗方式仍为手术切除,尽管近年来随着疾病筛查的普及和监测手段的先进化,早期小肾癌发现率越来越高,症状性肾癌的发生率逐渐减少,但临床中仍有不少局部进展期肾癌的病例检出,约20%～30%肾癌患者明确诊断时已发生淋巴结转移或静脉内癌栓形成。而转移性肾癌会大大减低患者的生存率和治疗效果；此外,即使患者进行了根治性手术切除,仍然有20%-30%患者术后3年内会出现复发及转移；再加上肾癌本身对传统放疗及化疗并不敏感,从而使得手术无法切除的晚期肾癌患者治疗较为困难,预后较差。因此,做到对肾癌患者的早期诊断及早期治疗,具有重要的临床意义。肾癌的早期发现及治疗依赖于对其发生机制的详细阐明。然而由于肾癌起因、发生及发展过程较为复杂,目前大量研究广泛涉及到多种机制、多个基因及分子的共同参与,且对各个方面因素的具体作用和重要程度无从判别,现阶段科学研究仍处于广撒网、多点突破的阶段,因此各个方面都被进行了研究。近年来,研究表明microRNA与多种恶性肿瘤的发生及发展密切相关,且由于其突出的作用,越来越被大家所重视和深入研究。在肾癌中,也发现多个]niRNA表达的异常,包括miR-200c、miR-141、miR-200c等。同时,研究发现在肾癌细胞系中过表达miR-200c、miR-141可下调ZEB2蛋白表达,从而抑制肿瘤细胞的黏附和侵袭；低表达于肾癌组织的miR-34a,通过调控YY1抑制肾癌细胞的增殖和侵袭；miR-27a可下调FOXO1表达,进而促进肾癌细胞的增殖；miR-134通过靶向调节KRAS,起到抑制786-O肾透明细胞癌细胞的上皮间质转化的作用。同时,近年来研究也发现miR-199a低表达于肾癌组织,可能作为一个抑癌基因,参与肾癌的发生,但其作用机制及其生物学功能研究尚少,很多机制尚未完全阐明,仍具有较大的潜在研究价值。为此,我们开展了本研究。目的1.探讨miR-199a在肾癌及癌旁相对正常组织中的表达,分析其表达与肾癌患者预后的关系；2.探讨niR-199a在肾癌中的表达对细胞增殖、侵袭及凋亡的影响；3.探讨miR-199a与其下游靶基因及上游调控基因的作用关系,阐明miR-199在肾癌中的作用机制；方法1.采用qRT-PCR定量检测miR-199a在39例肾癌患者肿瘤组织及其癌旁相对正常肾组织中的表达量,并分析miR-199a在肾癌中的表达与患者预后的关系。2.采用慢病毒感染的方法,构建稳定过表达miR-199a的A498细胞株和空载对照组细胞株,并采用qRT-PCR进行验证。3.采用MTT实验、平板克隆实验检测肾癌细胞的增殖情况；应用Transwell试验检测细胞的侵袭能力；利用流式细胞仪检测肾癌细胞的凋亡情况。4.通过靶基因预测网站,结合生物信息学分析筛选miR-199a下游的候选靶基因,明确ROCK1可作为miR-199a的直接靶基因。通过构建ROCK1突变体,将ROCK1与miR-199a共转染肾癌A498细胞株,采用荧光素酶报告实验检测miR-199a对野生型及突变型ROCK1荧光素活性的影响,探讨其作用关系。并采用MTT实验、平板克隆实验检测ROCK1与miR-199a共转染对肾癌细胞增殖能力的影响,采用流式细胞仪检测ROCK1与miR-199a共转染对肾癌细胞凋亡能力的影响。此外,通过qRT-PCR检测ROCK1在39例肾癌组织中的表达,分析其表达与miR-199a表达的临床相关性。5.通过分析miR-199a的DNA编码序列,结合生物信息学分析,寻找其上游调控基因,发现在miR-199的DNA序列中有一个Snail转录子的结合位点,初步预判Snail为miR-199的上游调控基因。通过基因克隆,获得miR-199a上游Snail启动子结合位点,再将Snail启动子结合位点及miR-199a共同转染A498细胞株,通过荧光素酶报告实验检测Snail与miR-199的荧光素活性,并结合Northern blot实验进一步验证Snail与miR-199a之间的作用关系。同时,采用qRT-PCR检测Snail在39例肾癌组织中的表达,分析其表达与miR-199a表达的临床相关性。结果1. miR-199a在肾癌组织中的表达及其意义首先我们检测了RNA提取的纯度,经1%琼脂糖凝胶电泳后,可见28S、18S、5S三条清晰的带型,未见DNA条带,表明所抽提的RNA无降解、无DNA污染,相对较纯,可用于逆转录及后续实验。随后,以U6作为内参,采用qRT-PCR检测了miR-199a在肾癌病变及癌旁组织中的表达。荧光定量PCR溶解曲线显示miR-199a及U6引物特异性高,无非特异性扩增和引物二聚体干扰,结果表明miR-199a表达于肾癌组织,与配对的癌旁组织相比,平均下调2-4倍,差异显著,有统计学意义(P<0.01)。结合患者的相关资料,我们分析了miR-199a表达与患者预后的关系。结果显示miR-199a下调病人平均生存时间为(41.147±8.713)个月,中位生存时间为34.4个月,miR-199a上调患者平均生存时间为(71.377±7.125)个月,中位生存时间分别为70.1个月。miR-199a低表达患者的1年及3年生存率分别为83.4%、14.7%；miR-199a高表达患者1年及3年生存率分别为93.2%、48.7%,二者差异显著,具有统计学意义(P<0.01)。经COX多因素分析,结果显示在排除肿瘤大小、TNM分期、临床分期等因素的影响后,miR-199a低表达可作为肿瘤特异性死亡的危险因素(RR=1.714,95%CI:1.127-2.216, P=0.03)。2. miR-199a通过调控靶基因ROCK-1影响肾癌细胞的增殖、侵袭及凋亡为明确miR-199a可能调控的靶基因,我们选择了3个预测软件预测结果的交集作为miR-199a的候选靶基因。结果表明R0CK1的mRNA序列中存在着miR-199a的一段互补序列,即结合位点。因此,我们认为ROCK1可能为miR-199a下游调控的直接靶基因之一。为了验证ROCK1是否为miR-199a的直接靶基因,我们构建了ROCK1野生型及突变型载体,并克隆形成荧光素酶载体,将其与空载对照载体分别与miR-199共转染肾癌A498细胞株。结果表明miR-199a明显抑制野生型ROCK1的表达(P<0.05),却不能影响突变型ROCK1表达。同时,我们采用qRT-PCR及Western blot检测野生型ROCK1在]miR-199a过表达细胞株中的表达情况,结果均显示miR-199a过表达后,ROCKl表达明显减低(P<0.01)。为探讨miR-199a调控靶基因ROCK-1对肾癌细胞增殖能力的影响,我们首先采用MTT实验检测了细胞的增殖能力,结果示miR-199a过表达明显抑制肾癌细胞的增殖；然而,当miR-199a与ROCK-1共转染后,ROCK-1在一定程度上可减轻miR-199a过表达对肾癌细胞增殖能力的抑制作用,但其增殖能力仍明显强于miR-199a过表组(P<0.01)。同时,我们也采用平板克隆实验检测了细胞的增殖能力,结果显示miR-199a过表达后,细胞的克隆数明显低于对照组,同时明显低于miR-199a与ROCK-1共转染组,提示miR-199a表达能明显抑制肾癌细胞的增殖。为探讨miR-199a调控靶基因ROCK-1对肾癌细胞侵袭能力的影响,我们进行了Transwell侵袭实验,结果示miR-199a过表达后,细胞的侵袭数明显低于对照组及miR-199a与ROCK-1共转染组,但是恢复ROCK-1的表达能部分抑制miR-199所引起的侵袭抑制作用(P<0.01)。为探讨miR-199a调控靶基因ROCK-1对肾癌细胞凋亡能力的影响,我们又进行了流式细胞仪检测,结果提示miR-199a过表达后,细胞凋亡率明显增加,但ROCK-1过表达能部分抑制miR-199a过表达所引起的细胞凋亡。3. miR-199a过表达及miR-199a/ROCK-1共表达对肾癌细胞体内生物学特性的影响为了进一步明确miR-199a对肾癌细胞生长的影响,我们将miR-199过表达及空载对照慢病毒转染了肾癌A498细胞株,行裸鼠体内成瘤实验,结果表明miR-199a过表达肾癌细胞在裸鼠体内的生长明显受到抑制,形成的肿瘤重量明显低于空载对照组。收集空载对照组(LV-ctrl)及miR-199a过表达实验组形成的肿瘤组织,采用免疫组化检测ROCK-1及增殖指标Ki-67的表达情况,结果显示ROCK-1在miR-199a过表达的实验组肿瘤中的表达明显低于对照组,Ki-67在miR-199a过表达的实验组肿瘤中的表达也明显低于对照组,提示miR-199a过表达后肿瘤的增殖及侵袭能力下降。随后,我们也通过qRT-PCR定量检测了ROCK-1在39例肾癌组织中的表达,并分析了其表达与肾癌组织中miR-199表达的关系。结果表明ROCK-1高表达于肾癌组织,其表达与miR-199a表达呈明显的负相关(P<0.01),相关系数为0.7665。4. miR-199a上游调控因子的预测和鉴定依据mRNA编码蛋白的原理,miRNA也是由其基因DNA转录而成,每一个miRNA的表达都是由一个启动子启动及转录因子调控。因此,我们查阅了相关基因的数据库,发现miR-199a基因序列中有一个Snail转录子的结合位点,初步判断Snail可能为miR-199a上游调控的候选基因。随后,我们将miR-199a上的Snail启动子结合位点进行了克隆,命名为pGL3-miR-199a pro,并进行了荧光素酶报告实验,结果显示这个位点的区域也包含了miR-199a的初级转录物的启动子,并可以激发荧光素的表达。同时,我们将pGL3-miR-199a pro及空载分别与Snail进行共转染,发现pGL3-miR-199a pro与Snail共转染后,荧光素表达活性明显降低。此外,qRT-PCR检测结果表明Snail过表达能抑制miR-199表达,Northern blot结果也显示Snail过表达能抑制miR-199a表达。为了进一步验证Snail与miR-199a的相关性,我们采用qRT-PCR定量检测了39例肾癌组织中Snail的表达,结果显示Snail高表达于肾癌组织,其表达与miR-199a呈负性相关关系,相关系数为0.6376(P<0.05)。因此,这些结果提示Snail是miR-199a的上游调控基因。结论1.miR-199a表达肾癌组织,其高表达患者预后较好;2. miR-199靶向调控下游基因ROCK-1,参与调控肾癌细胞的增殖、侵袭及凋亡；3. Snail为miR-199a的上游调控基因；本研究的创新之处1. 通过实验证实miR-199a低表达肾癌组织,其高表达患者预后较好；2. 首次揭示了miR-199a靶向调控下游基因ROCK-1,参与调控肾癌细胞的增殖、侵袭及凋亡；3. 首次明确了Snail可作为miR-199a的上游调控基因,进一步阐述了miR-199a在肾癌中的作用机制；