【摘 要】
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为了构建K.cicerisporus CBS4857表达系统,我们首先构建了该菌株的基因文库.通过将K.cicerisporus CBS4857基因文库转化酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae W303-1B,利用功能
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为了构建K.cicerisporus CBS4857表达系统,我们首先构建了该菌株的基因文库.通过将K.cicerisporus CBS4857基因文库转化酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae W303-1B,利用功能互补克隆KcURA3和KcHIS3基因.其中KcURA3基因编码乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶,其编码区为801bp,共编码267个氨基酸,BLAST分析显示与酿酒酵母ScURA3基因的蛋白同源度为87％;KcHIS3基因编码咪唑甘油磷酸脱水酶,其编码区为690bp,共编码230个氨基酸,BLAST分析显示与酿酒酵母ScHIS3基因的蛋白同源度为77％.利用5-FOA的反选择作用,获得了一株ura3菌株,命名为Y179U,经过验证发现该菌株的URA3基因+93密码子发生了一个点突变,由编码赖氨酸变为苏氨酸,导致其所编码的蛋白的酶活性中心被破坏此菌株被用作转化系统的宿主菌;以KcURA3基因作为选择性标记分别构建整合型和游离型载体,实现了Y179U菌株的载体的DNA转化;并且还对游离型载体pUKD进行了改建,使得改建后的载体pUKD-S在转化效率和稳定性上均优于pUKD载体.通过优化LiAC转化和电转化的条件,建立适于Y179U菌株的转化方法,获得了较高的转化效率,成功的建立了K.cicerisporus CBS4857的转化系统.在K.cicerisporus CBS4857转化系统为基础上,利用菊粉酶基因的启动子、终止子构建了乙肝表面抗原S-preS1融合基因的五种胞内表达载体,转化子的发酵产物ELISA检测结果及Western-blot结果均表明有乙肝表面抗原S-preS1融合基因的表达,其中以pUKD载体为基础的表达载体pUKD-PLT表达量最高,效价为3000.进而以菊粉酶基因的启动子、终止子以及酿酒酵母α-因子构建了干扰素α2b基因的五种分泌型表达载体,转化子发酵产物SDS-PAGE检测发现在20KD处有一条条带产生,大小与干扰素α2b一致,Western-blot证实该条带为干扰素α2b表达条带,实现了干扰素α2b基因在Y179U菌株中的表达.
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