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背景：大肠癌(colorectal cancer, CRC)是人类常见的恶性肿瘤之一,在我国其死亡率占癌症死亡人数的第四位。目前其发病机制尚未十分明确。研究发现,多种microRNAs (miRNAs, miRs)在大肠癌组织中存在差异表达,可能参与大肠癌的发生、发展过程。已有研究发现,miR-126在大肠癌组织中表达下调,可能发挥类似抑癌基因的功能。胰岛素受体底物1(Insulin receptor substrate-1, IRS-1)参与包括大肠癌在内的多种肿瘤的发生、发展。通过互联网上microRNAs靶基因预测系统预测miR-126靶基因显示,IRS-1的3’-UTR端有miR-126结合位点。究竟miR-126和IRS-1有何关系?miR-126是否调控IRS-1的表达?miR-126如何通过调节靶基因IRS-1在大肠癌发生中起作用?这种作用与IRS-1的信号通路的激活是否有关?这些均为本课题需要探讨的问题。本研究以大肠癌相关的mmiR-126及其靶基因IRS-1作为研究对象,拟从有限的microRNAs出发,研究microRNAs和IRS-1的关系及其对IRS-1基因、IRS-1相关的信号通路的调控作用,将有助于进一步阐明大肠癌的发病机理,以期应用microRNAs进行大肠癌等疾病的诊断,及应用microRNAs类似物和抑制剂治疗大肠癌等疾病有着重要的意义。第一部分miR-126与IRS-1在大肠癌组织中表达及其与临床病理特征的相关性研究目的：本研究检测大肠癌组织中miR-126、IRS-1mRNA及其蛋白的表达,了解miR-126的异常表达量与IRS-1蛋白和mRNA表达量的相关性关系,以及两者与大肠癌的临床病理参数是否有关,初步探讨miR-126与IRS-1在大肠癌的发生、发展过程中的可能机制,为进一步探索大肠癌的基因治疗提供理论依据和实验基础。方法：选取正常对照组20例、大肠癌组40例,大肠癌癌旁组28例,大肠腺瘤组26例研究对象的手术大体标本或肠镜下活检标本。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测上述各组组织mmiR-126及IRS-1mRNA的表达水平；采用蛋白免疫印迹(western blotting)法检测上述各组组织IRS-1蛋白的表达水平；采用免疫组织化学法检测各组组织IRS-1蛋白的表达及定位；分析大肠癌组织mmiR-126表达量与IRS-1蛋白和mRNA表达量的相关关系,及其与临床病理参数之间的关系。结果：大肠癌组miR-126相对表达量显著减少,较正常对照组下降61%,分别与正常对照组、大肠癌癌旁组和大肠腺瘤组比较,差异均有显著性(P<0.05)；而其余三组间相互比较,miR-126表达量无明显差异(P>0.05)。正常对照组、大肠癌组、大肠癌癌旁组和大肠腺瘤组四组组织IRS-1mRNA的表达量无显著差异,四组间相互比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。Western blotting检测大肠癌组IRS-1蛋白表达明显增高,分别与正常对照组、大肠癌癌旁组和大肠腺瘤组比较,差异均有显著性(P<0.05),但其余三组间相互比较,差异无统计学意义(P>0.05)。IRS-1蛋白主要在大肠癌细胞胞浆中表达。大肠癌组中IRS-1蛋白表达的阳性率为87.5%(35/40),显著高于正常对照组、大肠癌癌旁组及大肠腺瘤组,与三组分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05),而正常对照组、大肠癌癌旁组及大肠腺瘤组三组间相互比较,差异无统计学意义(P>0.05)。在大肠癌组中,miR-126表达量与IRS-1mRNA的表达量无显著相关(r=0.028,P>0.05),而miR-126表达量与IRS-1蛋白的表达量呈显著负相关关系(r=-0.420, P<0.05)。miR-126、IRS-1蛋白的异常表达与大肠癌的TNM分期和Dukes’分期相关,TNM分期或Dukes’分期越高,miR-126的表达量越低(P<0.05),而IRS-1蛋白的表达量越高(P<0.05)。结论：miR-126和IRS-1在大肠癌组织中存在差异表达,两者呈负相关趋势且与大肠癌的某些临床病理参数有关。miR-126可能通过调节IRS-1参与大肠癌的发生、发展过程。第二部分miR-126对大肠癌细胞生物学行为的影响及其对IRS-1和IRS-1信号通路调控机制的研究目的：大肠癌是目前世界上导致人类肿瘤相关死亡的原因之一。microRNAs在肿瘤的发生、发展过程起非常重要的作用。研究发现,miR-126在大肠癌中存在低表达。本实验主要研究miR-126对大肠癌细胞生物学行为的影响,阐明其对IRS-1及其信号通路的调控作用。方法：通过转染miR-126mimic或inhibitor至人大肠癌HT-29或HCT-116细胞株,应用qRT-PCR法检测IRS-1mRNA的表达；western blotting法检测IRS-1、 AKT、ERK1/2蛋白的表达；流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况；CCK-8法检测细胞增殖能力；Transwell小室检测细胞迁移、侵袭能力。双荧光素酶报告基因系统检测miR-126和IRS-1mRNA3’-UTR结合情况。结果：(1)miR-126在HT-29、HCT-116、SW480和SW620四株细胞中表达不同,在HCT-116细胞中表达高于其余三株细胞。(2)在单独转染质粒实验中,与转染空质粒组和PmiR-IRS-1-mut质粒组比较,转染PmiR-IRS-1-wt质粒组荧光素酶活性明显受到抑制,其差异有统计学意义(P<0.05)。在质粒和miR-126共转染实验中,转染PmiR-IRS-1-wt重组质粒组,转染miR-126mimic与NC组相比较,荧光素酶活性明显下降(P<0.05),而转染空质粒及转染PmiR-IRS-1-mut重组质粒组,转染miR-126mimic分别与各自NC组相比较,荧光素酶活性无明显变化(P>0.05)。(3)IRS-1主要在HCT-116细胞胞浆中表达。转染miR-126mimic组与NC组比较,miR-126的表达量明显增高(P<0.05),IRS-1、p-AKT和p-ERKl/2蛋白表达明显下降(P<0.05),而IRS-1mRNA、AKT、ERK1/2蛋白表达无差异(P>0.05)；转染miR-126inhibitor组与NC组比较,miR-126的表达量明显降低(P<0.05),IRS-1、p-AKT和p-ERKl/2蛋白表达明显增高(P<0.05),而IRS-1mRNA、AKT、ERK1/2蛋白表达无差异(P>0.05)。(4)转染miR-126mimic组,G1期细胞的百分比较NC组明显增高(P<0.05),而两组的细胞凋亡率无明显差异(P>0.05)。(5)转染miR-126mimic组与NC组比较,大肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力受到抑制,两组差异有显著性(P<0.05)；而转染miR-126inhibitor组与NC组比较,大肠癌细胞的迁移、侵袭能力增强,两组差异有统计学意义(P<0.05)。结论：miR-126可以调控大肠癌细胞的生物学行为,这种作用至少部分是通过调控IRS-1的表达及其AKT、ERK1/2信号通路的活化而发挥的。