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苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）在芽胞形成时期产生的晶体蛋白对昆虫、线虫等具有毒力。目前,Cry蛋白毒杀昆虫的机制研究的较清楚,提出了“穿孔机制”和“信号传导机制”等作用模型,在这些模型中钙粘蛋白（cadherin）是一种重要的受体。但是目前对杀线虫晶体蛋白的杀线虫机制了解的较少。Cry5B是一种对线虫具有高毒性的晶体蛋白,仅发现糖脂是其杀虫过程中的受体。在三维结构上,Cry5B和杀昆虫晶体蛋白Cry1A等高度相似。在实验室之前的研究中我们发现Cry5B在秀丽小杆线虫（Caenorhabditis elegans）中有类似于杀昆虫晶体蛋白Cry1A的寡聚化现象。综合以上现象,我们推论推测Cry5B具有与Cry1A类蛋白相似的杀虫机制。在穿孔模型中,钙粘蛋白是晶体蛋白的受体,它与毒素结合会介导毒素寡聚化。本研究中以模式生物秀丽小杆线虫为模型,去探究Cry5B杀线虫过程中钙粘蛋白的功能。秀丽小杆线虫中共有13种钙粘蛋白,其中CDH-5、CDH-7、CDH-8、CDH-10和CDH-12是线虫中所特有的。通过生物活性测定的方法,比较了Cry5B对野生型N2和线虫钙粘蛋白缺失突变株的活性差异,发现CDH-7、CDH-8的缺失突变株RB685和RB815对Cry5B分别有3.22和3.63倍左右的抗性,其它突变株无明显抗性,同时前期研究初步验证了钙粘蛋白CDH-7及CDH-8的部分区域与Cry5B存在相互作用,钙粘蛋白可能是Cry5B杀线虫过程中的受体。本研究中对钙粘蛋白CDH-7和CDH-8的功能进行了进一步的研究。此外,已报到糖脂是Cry5B的受体,本研究也进一步对钙粘蛋白与糖脂的关系进行了研究。结果如下:1.钙粘蛋白CDH-7及CDH-8与Cry5B存在高亲和力的相互作用。前期研究中对CDH-8的CR7、CR9-CR10、CR10-MPED及CDH-7的CR2-CR5区域进行了体外克隆表达,通过斑点杂交发现这些钙粘蛋白片段和Cry5B存在相互作用。本研究克隆了CDH-7近膜区CR5-MPED区域,通过斑点杂交验证了其和Cry5B存在相互作用。最后,通过竞争性Elisa验证了这些钙粘蛋白片段和Cry5B的专一性相互作用,结果发现CDH-8（CR7）、CDH-8（CR9-CR10）、CDH-7（CR2-CR5）及CDH-7（CR5-MPED）和Cry5B存在高亲和力的相互作用,平衡解离常数Kd值大约为1 nmol/L。2.体外添加的钙粘蛋白CDH-7和CDH-8抑制Cry5B对线虫的活性。在生测体系中添加20倍质量比的钙粘蛋白CDH-7（CR2-CR5）和CDH-8（CR7）,使Cry5B杀秀丽小杆线虫的致死率分别显著降低了22%和23%,而添加CDH-7（CR5-MPED）和CDH-8（CR9-CR10）对Cry5B的活性没有明显的改变。3.钙粘蛋白CDH-7和CDH-8介导Cry5B寡聚化。在体外验证了钙粘蛋白和Cry5B寡聚化的关系,在胰蛋白酶的作用下,Cry5B可以被激活成70 k Da的毒素单体,而存在钙粘蛋白CDH-8（CR7）、CDH-8（CR9-CR10）、CDH-7（CR2-CR5）及CDH-7（CR5-MPED）时,通过Western blot检测到了280 k Da的条带,说明Cry5B在钙粘蛋白的介导下形成了寡聚体。4.在Cry5B杀虫过程中钙粘蛋白CDH-7和CDH-8起协同作用。利用RNAi的方法构建了钙粘蛋白CDH-7和CDH-8缺失突变体,双突变对Cry5B的抗性强于单突变体,说明杀虫的过程中钙粘蛋白CDH-7和CDH-8是同时起作用的。5.杀虫过程中糖脂和钙粘蛋白发挥不同的作用。利用荧光物质标记Cry5B发现钙粘蛋白CDH-7和CDH-8基因的缺失不会干扰Cry5B进入肠道细胞,而糖脂受体与Cry5B从肠腔进入肠道细胞密切相关;同时,通过Western Blot发现,CDH-7和CDH-8缺失对Cry5B与线虫的结合抑制程度大于糖脂突变体,表明在毒素结合过程中钙粘蛋白的作用强于糖脂;生测数据发现,在糖脂缺失突变体中干扰钙粘蛋白不会影响突变体对Cry5B的抗性,而在钙粘蛋白缺失突变体中干扰糖脂会使线虫对Cry5B的抗性明显强于单突变体,表明杀虫过程中糖脂和钙粘蛋白共同起作用且糖脂的作用大于钙粘蛋白。在杀虫过程中钙粘蛋白和糖脂受体的功能不一样,两者先后起作用。本课题中证明了秀丽小杆线虫中的钙粘蛋白CDH-7和CDH-8是Cry5B的受体,并且验证了在杀虫过程中钙粘蛋白受体和糖脂受体先后发挥作用。