罗非鱼是一种在全世界广泛养殖的经济鱼类,近年来,以链球菌病为代表的罗非鱼病害频繁发生,给罗非鱼产业造成了巨大的经济损失,严重阻碍了该产业的健康发展。由于其较高的经济价值,对罗非鱼病害的研究逐渐成为水产动物病害防治领域的研究热点,而由无乳链球菌引起的链球菌病是其中一个主要的研究方向。然而,目前关于罗非鱼的T细胞,特别是关于T细胞激活方面的研究还十分有限。CD59、CD2BP2和Lck是三种与共刺激分子CD2存在互作的关键蛋白分子,在CD2介导的T细胞激活中起到着至关重要的作用。为了解罗非鱼T细胞对胞内寄生菌的免疫应答机制,本研究以尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)为研究对象,克隆了尼罗罗非鱼CD59、CD2BP2和Lck的cDNA序列全长,并对其组织分布、对无乳链球菌刺激的免疫应答以及功能特征进行了初步的研究。CD59是一种重要的补体抑制蛋白和T细胞调节蛋白,在非特异性免疫应答和特异性免疫应答中都发挥着重要的作用。在本研究中,尼罗罗非鱼的CD59基因(简称为On-CD59)被成功克隆,序列分析结果表明On-CD59的cDNA全长为1176 bp,包含一段长为74 bp的5’端非编码区、一段长为748 bp的3’端非编码区以及一段长为354 bp、编码117个氨基酸的开放式阅读框(ORF)。On-CD59所推测的氨基酸序列具有已知CD59分子所具有的五大特征结构,包括N端的信号肽、C端的GPI锚定区、中间的LU结构域、CCXXXXCN基序以及10个半胱氨酸残基。在健康的罗非鱼中,On-CD59 mRNA的表达在本研究所检测的所有组织中都能被检测到,其中在脑的表达量远高于其他组织;在经灭活无乳链球菌刺激24 h后,On-CD59 mRNA在皮肤、大脑、头肾、胸腺和脾脏的表达都发生了显著的上调。此外,在灭活无乳链球菌刺激后,On-CD59的表达在皮肤、脑、头肾、胸腺和脾脏表现出明显的时间依赖性表达模式,On-CD59在皮肤的表达水平于免疫12 h后达到峰值,而在脑和头肾则是于免疫24 h后达到峰值,在胸腺和脾脏到达峰值的时间最晚,为免疫48 h后。补体抑制活性试验结果表明On-CD59不但具有补体抑制活性,而且这种活性具有物种选择性。而生物素-链霉亲和素ELISA以及集落形成单位试验结果则分别表明,On-CD59能结合革兰氏阳性菌细胞壁的主要组分PGN和LTA,并对无乳链球菌具有一定的抗菌活性。CD2BP2是几种与CD2胞质区结合的接头蛋白之一,在CD2介导的T细胞激活以及核剪接中都起着关键的作用。在本研究中,尼罗罗非鱼的CD2BP2基因(简称为On-CD2BP2)被成功克隆,序列分析结果表明On-CD2BP2的cDNA全长为1429 bp,包含一段长为111 bp的5’端非编码区、一段长为193 bp的3’端非编码区以及一段长为1125 bp、编码374个氨基酸的开放式阅读框。On-CD2BP2所推测的氨基酸序列具有已知CD2BP2分子所具有的两大特征结构,即C端的GYF结构域和GPFXXXXMXXWXXXGYF基序,且其所推测的基因结构与已知的CD2BP2分子十分相似。在健康的罗非鱼中,On-CD2BP2 mRNA在头肾、脾脏和肝脏的表达量较高;在经灭活无乳链球菌刺激48 h后,On-CD2BP2 mRNA在头肾、脾脏和脑的表达都发生了显著的上调。此外,在灭活无乳链球菌刺激后,On-CD2BP2在头肾、脾脏和脑的表达表现出明显的时间依赖性表达模式。On-CD2BP2在脑的表达水平于免疫24 h后达到峰值,而在头肾和脾脏则是于免疫48 h后达到峰值。Lck在关于T细胞的分化、增殖和效应功能的信号转导中都起着至关重要的作用。在本研究中,尼罗罗非鱼的Lck基因(简称为On-Lck)被成功克隆,序列分析结果表明On-Lck的cDNA全长为2213 bp,包含一段长为286 bp的5’端非编码区、一段长为421 bp的3’端非编码区以及一段长为1506 bp、编码501个氨基酸的开放式阅读框。On-Lck所推测的氨基酸序列具有对于转导TCRs信号所不可缺少的几个结构特征,且其所推测的基因结构与已知的Lck分子十分相似。在健康的罗非鱼中,On-Lck mRNA在胸腺、脾脏、头肾和鳃的表达量较高;在经灭活无乳链球菌刺激后,On-Lck mRNA在胸腺、脾脏和头肾的表达都发生了显著的上调。此外,在灭活无乳链球菌刺激后,On-Lck在头肾、脾脏和脑的表达表现出明显的时间依赖性表达模式。On-Lck在胸腺和脾脏的表达水平于免疫48 h后达到峰值,而在头肾则是于免疫72 h后达到峰值。