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嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞(CART)和T细胞受体(TCR)修饰的T细胞免疫治疗是新型快速发展的免疫治疗策略。CAR赋予了T细胞抗原特异性的识别,激活和增殖,依赖于主要组织相容性复合物非依赖的途径。CAR目前发展为第三代,包含两个共刺激分子,CD28+CD134(OX40)或CD28+CD137(4-1BB),第三代CAR相比于第二代CAR,细胞因子分泌和裂解作用均增强,激活诱导的细胞死亡率降低。2012年,Kloss CC研究小组在《Nature Biotechnology》上发表的关于调整亲和力后双载体系统(CAR+CCR)的杀伤特异性及效能,该研究在提高双CAR系统的特异性的同时,也开启了调控CAR载体对抗原亲和力的新的优化方向。2015年9月《Cancer Research》上发表的两篇调整CAR载体对抗原的亲和力降低脱靶效应的研究,研究表明高亲和力的CAR-T细胞对EGFR抗原低水平的和高水平表达的肿瘤细胞均有较强的杀伤效能,而低亲和力的CAR-T细胞只杀伤EGFR高表达的肿瘤细胞,且杀伤效能与EGFR的表达量呈正相关,因此,本课题我们选取中等亲和力的CAR-T细胞进行研究,在杀伤肿瘤细胞的同时降低脱靶效应。调整CAR-T细胞的亲和力使其特异性杀伤肿瘤细胞,豁免低水平表达靶抗原的正常细胞,降低脱靶效应。但由于肿瘤组织的异质性,即肿瘤组织由于特殊的组织病理学的差异,靶抗原的表达量也会有所差异,降低CAR载体的亲和力,也会引起靶抗原低水平表达的肿瘤细胞逃逸,豁免正常细胞的同时也会降低疗效。因此,降低亲和力,靶向单个抗原分子的CAR-T细胞无法彻底消除所有的肿瘤细胞。EGFR家族EGFR(HER1/erbB-1),HER2(ErbB-2 or neu),HER-3(erbB-3)and HER-4(erbB-4)在乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、头颈部的癌症等多种肿瘤细胞中过表达,且家族成员在各种恶性肿瘤组织中的总阳性比例接近100%。基于上面的两个原因,我们构建了能同时靶向EGFR家族的中等亲和力G3Herin-CAR-T细胞,猜想并证明其靶向识别并杀伤多种恶性肿瘤细胞,且中等亲和力可以降低脱靶效应引起对正常组织的杀伤作用。第一部分:靶向EGFR家族嵌合抗原受体的构建选取靶向EGFR家族的中等亲和力HERIN片段并构建第三代CAR载体G3Herin-CAR,通过酶切鉴定及基因测序,证明我们成功构建了G3Herin-CAR载体。第二部分:靶向EGFR家族嵌合抗原受体对T细胞株的遗传修饰采用电穿孔技术把G3Herin-CAR载体质粒转入健康志愿者的外周血PBMC中,用2%AIM+IL-2对T细胞进行共培养。通过蛋白免疫印迹分析,流式细胞术(FCM)检测CAR-T转染的阳性率和激活表型的表达,验证通过电转染技术成功对T细胞株进行遗传修饰,并在T细胞内表达G3Herin-CAR目的基因。第三部分:靶向EGFR家族嵌合抗原受体修饰T细胞的体外效能检测本部分实验,采用蛋白免疫印迹分析、流式细胞术检测EGFR家族蛋白的表达筛选合适的肿瘤细胞,用Recombinant human EGFR抗原刺激G3Herin-CAR-T细胞,流式细胞术检测细胞因子IFN-r,TNF-a的分泌量,利用xCELLigence RTCA DP仪器实时检测CAR-T细胞对多种肿瘤细胞的杀伤效果,评估G3Herin-CAR-T细胞的体外细胞毒性效能。实验结果证明了最初的设计:靶向EGFR家族的中等亲和力pNBS328-G3Herin-CAR-T细胞对多种肿瘤细胞具有广谱的抗肿瘤效能,降低“脱靶效应”的同时保证了疗效。