一外泌体中TGFβ1在IgA肾病大鼠尿液中的表达及穿山龙总皂苷对肾脏的保护作用机制研究[目的]探讨穿山龙总皂苷(Dioscorea nipponica Makino)降低IgA肾病大鼠蛋白尿的作用,对肾脏病理损伤、肾组织中IV型胶原(Collage TypeⅣ,Col Ⅳ)、纤维连接蛋白(Fibronectin,FN)、层粘连蛋白(Laminin,LN)以及转化生长因子β1(Transform growth factorbeta1,TGFβ1)信号通路的影响,以及探索IgA肾病模型大鼠尿液外泌体中TGFβ1的表达。[方法]将健康SD大鼠分为空白组(N组),模型组(M组),替米沙坦组(T组),穿山龙高剂量组(DH组),穿山龙中剂量组(DM组),穿山龙低剂量组(DL组)适应性喂养一周后,将M组、T组、DH组、DM组、DL组大鼠进行造模,造模成功后分别给予相应药物治疗。其中N组、M组给予生理盐水,T组予替米沙坦溶液灌胃,DH组予穿山龙总皂苷高剂量灌胃,DM组予穿山龙总皂苷中剂量灌胃,DL组予穿山龙总皂苷低剂量灌胃,治疗8周后,留取各组大鼠尿液,血清与肾脏组织标本。检测各组大鼠24小时尿蛋白定量,血液生化指标:血清肌酐(Serum creatinine,Scr)、尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)、血清白蛋白(Serum albumin,ALB)、谷丙转氨酶(Glutamic-pyruvic transaminase,ALT)、谷草转氨酶(Glutamic oxalacetic transaminase,AST)水平;将肾组织进行HE染色、PASM染色、Masson染色,在光镜下观察肾小球变化;在透射电镜下观察肾组织超微结构的变化。采用免疫组化法、免疫印迹法(Western Blot)对肾组织ColⅣ、FN、LN、TGFβ1、smad3进行检测。采用超速离心法提取大鼠尿液中外泌体,使用透射电镜观察外泌体形态、检测外泌体标志蛋白并进行粒径检测以鉴定所提取物质为外泌体。使用Western Blot法检测尿液外泌体中TGFβ1蛋白的表达。[结果]1.穿山龙总皂苷对蛋白尿的作用:与N组相比,M组24小时尿蛋白定量显著增多(P<0.05);与M组相比,T组、DH组、DM组、DL组24小时尿蛋白定量均有明显降低(P<0.05);T组、DH组、DM组、DL组组间比较则无明显差异(P>0.05)。2.血液生化指标情况:与N组相比,M组、T组、DH组、DM组、DL组的Scr、BUN、ALB、ALT、AST水平无明显差异(P>0.05),且组间也无明显差异(P>0.05)。3.光镜下观察HE、PASM及Masson染色后的肾脏标本:N组:肾小球结构正常,血管腔清晰,系膜细胞与系膜基质未见增生、纤维化、玻璃样病变表现,球囊壁光滑。M组:肾小球表现出代偿性扩张和萎缩病变,血管球肿胀、充血,部分肾小球毛细血管球肿胀从出现明显的分叶状、结节状病变或压迫性萎缩。局部肾小球系膜基质增生,基底膜增厚,球囊壁变窄。T组:肾小球扩张程度略减轻,血管球轻度充血,系膜基质增生不明显,球囊壁未见粘连。DH组、DM组、DL组:病变明显比M组减轻,表现为血管球轻度,肾小球系膜基质轻度增生,基底膜轻度增厚,未见球囊粘连。以DH组、DM组较好,DL组效果略差。4.电镜下观察肾组织超微结构:N组系膜区未见电子致密物,足突排列有序,大小均一,基底膜厚薄一致;M组系膜区散在大片高密度电子致密物,足突大片融合,局部脱落,基底膜薄厚不一;T组系膜区散在少量高密度电子致密物,足突局部见融合,基底膜厚度较一致;DH组、DM组、DL组系膜区散在极少量高密度电子致密物,足突少量融合,基底膜薄厚不一5.肾组织免疫组化检测结果显示:与N组相比,M组肾组织ColⅣ、FN、LN、TGFβ1、smad3的表达水平升高(P<0.05);与M相比,T组、DH组、DM组、DL组colⅣ、FN、LN、TGFβ1、smad3的表达水平下降(P<0.05);T组、DH组、DM组、DL组组间比较colⅣ、FN、LN、TGFβ1、smad3的表达水平无差异(P>0.05)。6.肾组织western blot检测结果显示:与N组相比,M组肾组织ColⅣ、FN、LN、TGFβ1、smad3的表达水平升高(P<0.05);与M相比,T组、DH组、DM组、DL组ColⅣ、FN、LN、TGFβ1、smad3的表达水平下降(P<0.05);T组、DH组、DM组、DL组组间比较ColⅣ、FN、LN、TGFβ1、smad3的表达水平无差异(P>0.05)。7.Western Blot检测尿液外泌体中TGFβ1,结果显示:与N组相比,M组肾组织TGFβ1的表达水平升高(P<0.05);与M相比,T组、DH组、DM组、DL组TGFβ1的表达水平下降(P<0.05);T组、DH组、DM组、DL组组间比较TGFβ1的表达水平无差异(P>0.05)。[结论]1.穿山龙总皂苷可以降低IgA肾病大鼠蛋白尿且具有安全性。2.穿山龙总皂苷可以减少肾脏细胞外基质沉积,减轻肾脏纤维化程度。3.尿液外泌体中TGFβ1可反映病情变化程度。二 LPS诱导系膜细胞释放的外泌体对正常系膜细胞的影响[目的]1.探讨脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对系膜细胞外泌体的影响。2.探讨LPS环境下系膜细胞释放的外泌体中TGFβ1对正常系膜细胞活化、增殖、产生细胞外基质的影响。[方法]将系膜细胞分为空白组(NL组)、LPS组,LPS+TGFβ1siRNA组,分别给予正常培养基,含有LPS培养基,含有LPS+TGFβ1siRNA的培养基培养48小时后,采用CCK8法检测三组细胞的增殖情况,采用ELISA法检测三组细胞液中细胞外基质FN、LN,Western Blot法检测各组细胞中TGFβ1、smad3及p-smad3的表达,RT-PCR法检测各组细胞中TGFβ1RNA、smad3RNA表达。提取各组细胞培养液中的外泌体,对外泌体进行鉴定,检测各组外泌体中的TGFβ1含量。将空白组、LPS组、LPS+TGFβ1siRNA组同等数量细胞产生的外泌体加入正常系膜细胞中,分为外泌体空白组(EXO+NL组),外泌体LPS组(EXO+LPS组),外泌体LPS+TGFβ1siRNA组(EXO+LPS+TGFβ1siRNA组)和无外泌体组(即正常培养,不加入外泌体,标记为NEXO组),采用CCK8法检测四组细胞的增殖情况,采用ELISA法检测四组细胞液中细胞外基质FN、LN、Col Ⅳ,以及Western Blot法RT-PCR法检测各组细胞中TGFβ1、smad3及p-smad3的蛋白及基因的表达。[结果]1.CCK8检测NL组、LPS组、LPS+TGFβ1siRNA组细胞增殖结果表明:与NL组相比,LPS组细胞明显增殖(P<0.05);LPS+TGFβ1siRNA组与NL组比较,细胞增殖较NL组略多,但无统计学差异(P>0.05),与LPS组相比,LPS+TGFβ1siRNA组细胞增殖明显降低(P<0.05)。2.ELISA法检测NL组、LPS组、LPS+TGFβ1siRNA组细胞中ECM,结果显示:与NL组相比,LPS组Fn、LN、CollⅣ的表达均上升(P<0.05);与LPS组相比,LPS+TGFβ11siRNA 组 FN、LN、ColⅣ 均降低(P<0.05)。Western Blot法检测 NL 组、LPS 组、LPS+TGFβ11siRNA 组细胞中 TGFβ1、smad3 及 p-smad3,结果显示:与NL组相比,LPS组TGFβ1、smad3及β-smad3的表达均上升(P<0.05);与 LPS 组相比,LPS+TGFβ1siRNA 组以及 TGFβ1、smad3 及 p-smad3 均降低(P<0.05)。RT-PCR法检测各组细胞中TGFβ1RNA、smad3RNA,结果趋势与Western Blot法所检测结果相同。3.外泌体鉴定:经超速离心后分离出的囊泡样本中CD9、CD81(外泌体的标志蛋白)表达阳性,细胞内质网标志蛋白-钙连蛋白(Calnexin)表达阴性;电镜观察发现外泌体为典型的圆形囊泡;粒径分析检测囊泡大小峰值在30-150nm之间,证明所提取囊泡为外泌体,且无细胞污染。4.Western Blot法、RT-PCR法检测NL组、LPS组、LPS+TGFβ1siRNA组培养液中外泌体TGFβ1蛋白及基因含量,结果表明:与NL组相比,LPS组外泌体中TGFβ1含量明显增多(P<0.05);与LPS组相比,LPS+TGFβ1siRNA组外泌体中TGFβ 1含量降低(P<0.05)。5.采用 CCK8 法检测 EXO+NL 组、EXO+LPS 组、EXO+LPS+TGFβ1siRNA组、NEXO组细胞增殖结果表明:与EXO+NL组相比,EXO+LPS组细胞明显增殖(P<0.05),EXO+LPS+TGFβ1siRNA 组、NEXO 组细胞增殖无明显差异(P>0.05);与EXO+LPS组相比,EXO+LPS+TGFβ1siRNA组细胞增殖明显降低(P<0.05)。6.ELISA法检测EXO+NL组、EXO+LPS组、EXO+LPS+TGFβ1siRNA组、NEXO组细胞中ECM,结果显示:与EXO+NL组、NEXO组相比,EXO+LPS组FN、LN、Col Ⅳ的表达均上升(P<0.05);与EXO+LPS组相比,EXO+LPS+TGFβ1siRNA组FN、LN、Col Ⅳ均降低(P<0.05)。Westen Blot法检测EXO+NL组、EXO+LPS组、EXO+LPS+TGFβ1siRNA组、NEXO组细胞中TGFβ1、smad3、p-smad蛋白含量,结果显示:与EXO+NL组、NEXO组相比,EXO+LPS组TGFβ1、smad3及p-smad3的表达均上升(P<0.05);与EXO+LPS组相比,EXO+LPS+TGFβ1siRNA组TGFβ1、smad3及p-smad3均降低(P<0.05)。、RT-PCR法法检测EXO+NL组、EXO+LPS 组、EXO+LPS+TGFβ1siRNA 组、NEXO 组细胞中 TGFβ1RNA、Smad3RNA含量,结果趋势与Western Blot法一致。[结论]1.LPS可增加系膜细胞外泌体中TGFβ1含量。2.外泌体中TGFβ1可促使系膜细胞增殖,增加细胞外基质沉积。三穿山龙总皂苷通过干预外泌体中TGFβ 1保护系膜细胞减少细胞外基质的产生[目的]证明LPS环境下,穿山龙总皂苷可通过干预系膜细胞释放的外泌体中TGF β1对系膜细胞活化、增殖及细胞外基质进行调节。[方法]将系膜细胞分为空白组(NL组),LPS组,LPS+TGFβ1siRNA组,LPS+穿山龙总皂苷组(LPS+CSL组),LPS+TGFβ1siRNA组+穿山龙总皂苷组(LPS+CSL+TGFβ1siRNA组),分别给予正常培养基,含有LPS培养基,含有LPS+TGFβ1siRNA、LPS+穿山龙总皂苷、LPS+TGFβ1siRNA+穿山龙总皂苷的培养基培养48小时后,采用CCK8法检测五组细胞的增殖情况,采用ELISA法检测五组细胞液中细胞外基质FN、LN、Col Ⅳ,Western Blot法检测各组细胞TGFβ1、smad3及p-smad3的表达,RT-PCR法检测各组细胞中TGFβ1RNA、smad3RNA含量。提取各组细胞培养液中的外泌体,对外泌体进行鉴定,Western Blot法、RT-PCR法检测各组外泌体中的TGFβ1蛋白及基因含量。将空白组、LPS组、LPS+TGFβ1siRNA组、LPS+穿山龙总皂苷组、LPS+TGFβ1siRNA组+穿山龙总皂苷组同等数量细胞产生的外泌体分别加入数量相当的正常系膜细胞中,分为外泌体空白组(EXO+NL组),外泌体LPS组(EXO+LPS组),外泌体LPS+TGFβ1siRNA组(EXO+LPS+TGFβ1siRNA组),外泌体LPS+CLS组(EXO+LPS+CSL组),外泌体LPS+TGFβ1siRNA组+穿山龙总皂苷组(EXO+LPS+TGFβ1 siRNA+CSL组)和无外泌体组(即正常培养,不加入外泌体,标记为NEXO组),采用CCK8法检测六组细胞的增殖情况,采用ELISA法检测六组细胞液中细胞外基质:FN、LN、Col Ⅳ含量,Western Blot法检测各组细胞TGFβ1、smad3及p-smad3的表达,RT-PCR法检测各组细胞TGFβ 1RNA、smad3RNA含量。[结果]1.CCK8 检测 NL 组、LPS 组、LPS+TGFβ1siRNA 组、LPS+CSL 组、LPS+CSL+TGFβ1siRNA组细胞增殖结果表明:与NL组相比,LPS组细胞明显增殖(P<0.05);与 LPS 组比较,LPS+TGFβ1siRNA 组、LPS+CSL 组、LPS+CSL+TGFβ1siRNA组细胞增殖降低,且有统计学差异(P<0.05),但LPS+TGFβ1siRNA 组、LPS+CSL 组、LPS+CSL+TGFβ1siRNA 组组间无统计学差异(P>0.05)。2.ELISA 法检测 NL 组、LPS 组、LPS+TGFβ1siRNA 组、LPS+CSL 组、LPS+CSL+TGFβ1siRNA组细胞中ECM,结果显示:与NL组相比,LPS组FN、LN、Col Ⅳ 的表达均上升(P<0.05);与 LPS 组相比 LPS+TGFβ1siRNA 组、LPS+CSL组、LPS+CSL+TGFβ1siRNA 组 FN、LN、Col Ⅳ 均降低(P<0.05);LPS+TGFβ1siRNA 组、LPS+CSL 组、LPS+CSL+TGFβ1siRNA 组 FN、LN、ColⅣ 无统计学差异(P>0.05)。Western Blot 法检测 NL 组、LPS 组、LPS+TGFβ1siRNA组、LPS+CSL 组、LPS+CSL+TGFβ1siRNA 组细胞中 TGFβ1、smad3 及 p-smad3,结果显示:与NL组相比,LPS组TGFβ1、smad3及p-smad3的表达均上升(P<0.05);与 LPS 组相比 LPS+TGFβ1siRNA 组、LPS+CSL 组、LPS+CSL+TGFβ1siRNA 组TGFβ1、smad3 及 p-smad3 均降低(P<0.05);LPS+TGFβ1siRNA 组、LPS+CSL组、LPS+CSL+TGFβ1siRNA 组 TGFβ1、smad3 及 p-smad3 无统计学差异(P>0.05)。RT-PCR法检测各组细胞TGFβ1RNA、smad3RNA含量,结果趋势与Western Blot法结果一致。3.外泌体鉴定:经高速离心后分离出的囊泡样本中CD9、CD81表达阳性,Calnexin表达阴性;电镜观察发现外泌体为典型的圆形囊泡;粒径分析检测囊泡大小峰值在30-150nm之间,证明所提取囊泡为外泌体,且无细胞污染。4.Western Blot法检测NL组、LPS组、LPS+TGFβ1siRNA组、LPS+CSL组、LPS+CSL+TGFβ1siRNA组培养液中外泌体TGFβ1含量,结果表明:与NL组相比,LPS组外泌体中TGFβ 1含量明显增多(P<0.05);与LPS组相比,LPS+TGFβ1 siRNA组、LPS+CSL组、LPS+CSL+TGFβ1siRNA组TGFβ1 含量降低(P<0.05)0RT-PCR法检测外泌体中TGFβ1RNA,结果趋势与Western Blot法结果一致。5.CCK8 检测 EXO+NL 组、EXO+LPS 组、EXO+LPS+TGFβ1siRNA 组、EXO+LPS+CSL 组、EXO+LPS+CSL+TGFβ1siRNA+组、NEXO 组细胞增殖结果表明:与EXO+NL组、NEXO组相比,EXO+LPS组细胞明显增殖(P<0.05);与 EXO+LPS 组相比,EXO+LPS+TGFβ1siRNA 组、EXO+LPS+CSL 组、EXO+LPS+CSL+TGFβ 1 siRNA+组细胞增殖明显降低(P<0.05)。6.ELISA法检测 EXO+NL组、EXO+LPS组、EXO+LPS+TGFβ1siRNA组、EXO+LPS+CSL组、EXO+LPS+CSL+TGFβ1siRNA+组、NEXO组细胞中ECM,结果显示:与EXO+NL组、NEXO组相比,EXO+LPS组FN、LN、ColⅣ的表达均上升(P<0.05);与EXO+LPS组相比,EXO+LPS+TGFβ11siRNA组、EXO+LPS+CSL组、EXO+LPS+CSL+TGFβ1sisiRNA+组FN、LN、ColⅣ均降低(P<0.05)。Western Blot 法检测 EXO+NL 组、EXO+LPS 组、EXO+LPS+TGFβ1siRNA 组、EXO+LPS+CSL组、EXO+LPS+CSL+TGFβ1siRNA+组、NEXO组细胞中TGFβ1、smad3及p-smad3的表达,结果显示:与EXO+NL组、NEXO组相比,EXO+LPS组TGFβ1、smad3 及 p-smad3 的表达均上升(P<0.05);与 EXO+LPS 组相比,EXO+LPS+TGFβ1siRNA组、EXO+LPS+CSL组、EXO+LPS+CSL+TGFβ 1siRNA+组TGFβ1、smad3及p-smad3均降低(P<0.05)。RT-PCR法检测TGFβ1RNA、smad3RNA,结果趋势与Western Blot法结果一致。[结论]穿山龙总皂苷可通过干预细胞外泌体中TGFβ1抑制系膜细胞增殖,减轻细胞外基质沉积