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研究背景与目的:禽流感病毒是一种可引起急性呼吸道传染病的人畜共患病毒。自2013年出现首例人感染H7N9型禽流感病例以来,造成了巨大的经济损失。虽然目前已有针对我国禽流感流行病学和H7N9型禽流感抗体的报道,但是针对江苏省地区近年来禽流感调查较为匮乏且H7N9型禽流感新型抗体报道不足。在此背景下,本研究将对2017年-2019年江苏省禽类及外环境禽流感分布情况与变化趋势、禽流感职业暴露人群H5N6、H7N9和H9N2型禽流感感染流行病学特征与危险因素进行横断面调查研究。本研究还将从自然感染H7N9型禽流感病毒康复期病人的全血中筛选得到全新的全人源H7N9型禽流感单克隆中和抗体并进行功能性验证。本课题将初步探索抗体与血细胞血凝素蛋白(hemoagglutinin,HA)复合物的晶体结构,明确中和抗体的抗原结合关键表位,可以达到应急预防或针对性治疗的作用,具有广泛的应用前景。研究方法:2017年-2019年,在江苏省13市通过整群随机抽样的方法选取活禽市场、规模养殖场、屠宰加工厂、野生禽鸟栖息地、散养户集中地区进行采集禽类和相应环境标本。样本经过核酸检测分型后进行统计分析,探索禽类禽流感的感染情况及相关环境中禽流感的分布。此外,在江苏省苏州、扬州和淮安三市的养殖场和活禽市场等场所中每年开展两次职业暴露人群感染的流行病学调查工作,符合纳入标准的人群填写调查问卷、获取收集人口学信息并采集血清样本。通过对样本进行血凝抑制(hemagglutination inhibition,HI)实验来判定血清抗体阳性率并对数据进行统计分析,以此评估不同亚型流行病学分布并掌握职业暴露人群相关危险因素。针对H7N9型禽流感全人源中和抗体研究,本课题通过从康复期病人的全血中用流式细胞仪筛选特异性的记忆性单个B细胞并提取核酸,用特异性的抗体轻重链引物进行RT-PCR扩增并构建抗体序列。采用转化TOP10感受态细胞和无内毒素质粒大提试剂盒来大量表达并提取抗体质粒。抗体和抗原蛋白则分别采用293F细胞和昆虫杆状病毒系统进行表达纯化。采用酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)等功能性实验进行中和活性验证。此外,H7N9型病毒的HA蛋白和全人源中和抗体所形成复合物的三维构造通过冷冻电镜方式进行分析,确定关键氨基酸位点。研究结果:(1)禽类及外环境禽流感监测中共采集样本14479份,甲型禽流感PCR阳性检出1998份,总体阳性率为13.8%,H9型、H7型、H5型禽流感阳性率分别为8.8%、3.9%、1.1%。不同采样年份的H5、H7、H9型禽流感阳性率有统计学差异(P<0.001),且冬春季节阳性率普遍高于夏秋季节。苏南地区的甲型禽流感阳性率普遍高于苏中和苏北城市,是禽类感染禽流感病毒的流行区(x~2=437.959,P<0.001)。不同监测场所的甲型禽流感阳性检出率有统计学差异(x~2=699.173,P<0.001)。其中,城乡活禽市场和禽类加工屠宰场为感染禽流感高风险场所。此外,用于擦拭屠宰或放置禽类肉制品的案板表面标本、清洗禽类的污水和擦拭笼具的标本均属于感染禽流感高风险样本。(2)职业暴露人群血清学监测调查共采集到1253个研究对象的血清样本,结果显示H5N6型禽流感血清抗体阳性率为0.6%,H7N9型禽流感阳性率为2.2%,H9N2型禽流感阳性率为0.7%。人口学信息显示,年龄及性别因素在本研究中未见差别。淮安为职业暴露人群H7N9型禽流感感染风险区,血清阳性率为5.4%(19/351)。三个采样城市的血清阳性率之间有统计学差异(x~2=22.611,P<0.001)。不同采样年份的H7N9型禽流感感染也有统计学差异(x~2=17.803,P<0.001)。相关危险因素分析发现活禽市场和家禽屠宰加工厂相比其他场所更容易检出阳性样本,市场活禽交易人员相比其他暴露方式人员更易感染。此外,接触三种种类禽类的暴露人员感染H7N9风险比接触单种禽类和两种的都要高(x~2=9.666,P=0.020)。(3)本研究中利用流式细胞术从H7N9型禽流感患者康复期外周血的单个核细胞中分选获得特异性针对H7N9型禽流感HA的单个B细胞。ELISA及免疫印迹实验(Western Blot,WB)均表明全人源单克隆中和抗体m Ab910及m Ab6137能够与H7N9型禽流感的HA特异性结合。HI、微量中和实验(microneutralization,MN)及小鼠攻毒实验的结果均显示这两种新型的中和抗体具有良好的H7N9型禽流感中和活性,提示其有可能预防和阻止人群感染H7N9型禽流感。通过抗原抗体孵育结合形成复合物后用高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)可见复合物的曲线明显高于抗原峰值并且出现时间较早,很大程度上预示着复合物的形成。研究结论:江苏省13个地级市的禽类及相关外环境中均检测到多种型别禽流感病毒,其中以城乡活禽市场和屠宰禽类加工厂为代表的监测地点为重点污染区域。职业暴露人群中普遍存在H5N6、H7N9和H9N2型禽流感病毒感染,淮安地区感染风险相比其它两地较高。H7N9型禽流感感染率在近年来有所上升。监测场所、标本类型、暴露方式、职业种类以及接触禽类种类可能是禽流感感染的危险因素。本课题筛选出两株全新的H7N9型禽流感全人源单克隆抗体且具有中和活性,这两株抗体也可与H7N9型禽流感HA蛋白进行结合。为进一步探索中和抗体的抗原结合关键表位,本研究将针对抗原抗体复合物进行冷冻电镜或者培养出可用于分析的蛋白晶体进行X线衍射,以此为特异性靶向免疫制剂的设计和研发提供科学依据。