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肌氨酸氧化酶(Sarcosine oxidase,EC 1.5.3.1,SOX)属于黄素酶,以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅基,它可催化肌氨酸N-甲基的氧化还原,是检测血清或尿液中肌酐含量的关键酶。本研究以探究SOX-辅基/配体之间的相互作用,来揭示黄素结构对黄素酶构象与功能的影响。利用不含辅基的重组SOX包涵体进行透析复性,以期重现无辅基SOX与类辅基配体的复合。主要研究内容如下:(1)建立快速高效的SOX辅基排除-重构体系。利用不含辅基的重组SOX包涵体进行透析复性,复性过程在透析外液中添加足量的FAD,以期重现SOX与类辅基配体的复合。探究复性过程中添加辅基的具体方法,促使酶蛋白本体在正确折叠的过程中识别并螯合辅因子,呈现出酶学活性。研究表明,SOX包涵体最优复性条件为:酶蛋白浓度0.3 mg·m L-1,透析外液pH为8.5,温度4℃,氧化还原值(GSH/GSSG)为2.0,复性时间为24 h。(2)基于FAD/FMN的核心结构异咯嗪环,对类辅基配体的理性筛选。首先根据文献报道来针对黄素的核心结构异咯嗪环选取一些有特点的类辅基;然后利用SOX三维结构进行同源模拟,其结构模板为Bacillus sp.NS-129(PDB code:1zov),以Accelrys Discovery Studio和www.Swiss-Dock.com在线软件为工具,模拟辅基与SOX的对接。同时选取天然辅基FMN、核黄素以及人工配体,通过模拟复合后形成氢键的数目、能量、Fullfitness等参数的不同也为后期实验研究提供了理论依据。(3)利用无辅基SOX与类辅基配体相结合,通过复合酶结构的二级结构、比酶活与稳定性的改变,探究类辅基配体与酶蛋白之间的相互作用。研究发现配体结构异咯嗪环3-N位的改变对于酶的整体结构有着非常重要的作用,它影响脱辅基蛋白与异咯嗪环的连接,同样也对电子氧化传递链中电子的传递起着非常关键的作用,从而导致复合酶的比酶活仅为SOX的20%;配体结构异咯嗪环7-C、8-C位的改变对酶结构有影响不如3-N位明显。不同的黄素酶与辅基及类配体的结合方式不同,酶的改造方式亦需分门别类具体处理之。