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研究目的:本研究的目的是观察不同运动时间和运动负荷下miR-199a和mTOR的mRNA表达及mTOR磷酸化和蛋白表达、P70S6K蛋白表达的变化,研究不同时间、不同负荷下心肌细胞内信号的变化规律,从分子生物学角度探讨运动对心肌蛋白代谢调节过程的影响。方法:实验对象为野生型斑马鱼系,健康的成年三月龄斑马鱼150只,随机分为4周和8周安静对照组(C)、4周恒定负荷组(E1)、4周递增负荷组(E2)、8周恒定负荷组(H1)、8周递增负荷组(H2)。在对照组中,对照组按以上方法饲养4或8周。训练组按照-Wood、Pelster[1,2]的方法进行训练,为期4周和8周,第一周每天上午驱赶训练5 min一次,以后七周上午的训练量不变。每天下午驱赶训练5 min,从第二周开始,每天上午训练量保持不变,下午每周加1 min。即第二周下午的训练时间为6 min,剩下几周分别为累加。4周饲养或训练结束后,分别取材;8周饲养或训练结束后,分别取材。分别在最后一次驱赶训练后进行称重,每条鱼解剖之前在事先准备的鱼缸中加入麻醉药,用解剖刀迅速解剖,用镊子将心肌组织取出。称重检测心系数;采用HE染色法对斑马鱼的各组心肌组织的差异进行观测;对于miR-199a和mTOR mRNA在斑马鱼心脏中的表达,采用实时荧光定量PCR检测;使用蛋白质印迹(Western blot),测量各组斑马鱼心肌中mTOR蛋白表达及磷酸化表达,p70S6K蛋白表达。结果:(1)心系数:E1组、E2组、H1组、H2组斑马鱼心系数与C组相比较,增加显著(P<0.01);E2组、H2组斑马鱼心系数呈现出很明显高于E1组的趋势(P<0.01);H2组斑马鱼心系数也比H1组增加显著(P<0.01)。(2)miR-199a mRNA:相较于 C 组 E1 组斑马鱼 miR-199a mRNA表达增加(P<0.05);与C组相较E2组、H1组、H2组斑马鱼miR-199a mRNA表达上升趋势显著(P<0.01);与E1组进行对比发现,E2组、H2组的斑马鱼miR-199amRNA表达具有极度显著性的差异(P<0.01);与H1组对比发现,H2组斑马鱼miR-199amRNA表达也表现出明显上升趋势(P<0.01)。(3)mTOR mRNA:相较于C组E1组斑马鱼mTOR mRNA表达上升,但两组之间的差别不够明显(P>0.05),与C组相较E2组斑马鱼mTOR mRNA表达明显上升(P<0.05),与C组进行对比发现,H1组、H2组斑马鱼mTOR mRNA表达呈现出非常明显的上升(P<0.01);与E1组相比,E2组的斑马鱼mTOR mRNA表达存在上升的趋势,同样两组之间的差别不够明显(P>0.05),与E1组进行对比发现,H2组斑马鱼mTOR mRNA表达增加差异显著(P<0.01);与H1组相比H2组斑马鱼mTOR mRNA表达大幅度上升(P<0.01)。(4)mTOR的蛋白表达以及其磷酸化:与C组相比,E1组、E2组、H1组、H2组斑马鱼心肌mTOR蛋白表达增加显著(P<0.01);与E1组相比,E2组、H1组斑马鱼心肌mTOR蛋白表达同样增加明显(P<0.01);与H1组相比,H2组斑马鱼心肌mTOR的蛋白表达呈先增大的趋势,但趋势不是特别明显(P>0.05)。与C组相比,E1组、E2组、H1组、H2组斑马鱼心肌mTOR磷酸化表达显著上升(P<0.01);与E1组相比,E2组、H1组斑马鱼心肌mTOR磷酸化大幅度上升(P<0.01);与H1组相比,H2组斑马鱼心肌mTOR磷酸化小幅度上升(P<0.05)。(5)P70S6K蛋白表达:与C组相比,E1组、E2组、H1组、H2组斑马鱼心肌P70S6K蛋白表达上升幅度明显(P<0.01);与E1组相比,E2组、H1组斑马鱼心肌P70S6K蛋白表达大幅度上升(P<0.01);与H1组相比,H2组斑马鱼心肌P70S6K蛋白表达小幅度上升(P<0.05)。结论:(1)长期运动诱导斑马鱼发生心肌肥大,且心肌肥大程度同运动强度相关。(2)运动诱导斑马鱼心肌细胞体积明显增大,长度延长,直径增大,出现生理性改变。(3)在运动性心肌肥大过程中miR-199a表达上升,且靶定对肌细胞分化起着非常重要的mTOR信号通路,miR-199a对mTOR表达存在正比例关系。(4)运动刺激mTOR磷酸化激活mTOR,4周负荷强度运动mTOR蛋白表达的变化幅度不如8周负荷强度运动。