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背景:AD(Alzheimer’s disease)是最常见的神经退行病变,细胞外老年斑(senile plaque,SP)的沉积是AD重要的特征是最常见的神经退行病变,细胞外老年斑(senile plaque,SP)的沉积是AD重要的特征性神经病理学变化之一。SP由前体蛋白APP剪切而生成的β切淀粉样蛋白(β粉样蛋白(β经病,A粉)聚集而成。β分泌酶(亦称BACE1)剪切APP生成C端片段(C99)和N端片段(sAPP1),C99再经分泌酶剪切生成具有神经毒性的A经分泌酶剪切生成以及C端片段(C57,C59),因此BACE1剪切APP是AP生成的关键步骤,BACE1是AA生成的关键酶。AD病人脑内BACE1表达量显著增加,但目前相关机制不清。苏木化修饰(SUMOylation)作为一种重要的翻译后修饰,其过程是苏木小体(SUMO1-4)在一系列酶的作用下结合与于靶蛋白的特异序列:ψ-K-X-D/E(ψ代表疏水性氨基酸,X代表任意氨基酸)或NDSM(负电荷依赖的苏木结合序列),其功能是通过对底物蛋白进行苏木化修饰改变靶蛋白的构象、功能、稳定性以及亚细胞定位。现有研究表明苏木化修饰在AD的病理过程中发挥重要作用,基因组学研究发现苏木化相关的基因是AD重要的危险因素,在Tg2576转基因模型鼠脑内SUMO1水平升高并与磷酸化Tau蛋白共定位。课题组前期的研究也证实细胞中Tau蛋白SUMO1修饰与磷酸化相互促进,与泛素化相竞争,从而减少Tau降解,促进Tau聚集。然而SUMO1是否参与Aβ的形成以及相关机制尚不清晰。我们通过苏木化位点预测软件SUMOsp 2.0对BACE1进行预测,发现BACE1存在着苏木小体结合的特异序列274LKMD277和495DDISLLK501,提示BACE1可能与苏木小体结合。目的:探讨BACE1苏木化修饰对Aβ的产生和认知障碍的影响及潜在的机制,为AD药物开发提供有效特异的分子靶点。方法:培养HEK293T或N2A-APP细胞,同时瞬时转染BACE1、SUMO1和苏木特异性连接酶UBC9,并在整体水平AAV-BACE1定位注射C57小鼠海马,通过免疫共沉淀方法检测BACE1与苏木小体SUMO-1结合程度。通过SUMOsp 2.0预测BACE1可能的苏木修饰位点,对其定位点突变K275R和K501R,并将突变或野生型的BACE1与SUMO-1、UBC9共转HEK293T或N2A-APP细胞,通过免疫共沉淀方法检测BACE1苏木化修饰水平。苏木化位点特异性突变的BACE1、野生型BACE1与UBC9共转N2A-APP细胞,利用免疫印迹和ELISA方法检测BACE1苏木化修饰对APP的剪切以及Aβ生成的影响,通过激光共聚焦检测苏木化修饰对BACE 1亚细胞分布的影响。100mg/ml放线菌酮(Cycloheximide,CHX)对转染后的N2A-APP细胞给予不同时间段的处理,免疫印迹检测苏木化修饰对BACE1稳定性的影响。通过逆转录和RT-PCR确定苏木化修饰是否影响BACE1的mRNA表达水平。C57小鼠海马定位注射AAV-Vcctor、AAV-BACE1WT、AAV-BACE1K501R,通过旷场、水迷宫实验来检测行为学的变化,激光共聚集荧光显微镜下观察MAP2表达水平和BACE1蛋白的亚细胞定位,高尔基染色检测树突棘的变化,免疫印迹实验检测小鼠海马Synaptotagmin,Synaptophysin,Synapsin 1,PSD93,PSD95和GluR1 等突触蛋白以及APPβ,BACE1 的变化。AAV-Vector、AAV-BACE1WT、AAV-BACE1K501R定位注射APP/PS1小鼠海马,通过旷场、条件恐惧实验来检测行为学的变化,通过硫磺素染色观察BACE1苏木化修饰对Aβ斑块形成的影响。原代海马神经元细胞给予0、40、400nMAβ1-4224小时后,通过免疫印迹和免疫共沉淀方法检测BACE1苏木化修饰水平。最后,通过免疫印迹和免疫共沉淀方法检测3、6、12月龄的APP/PS1小鼠BACE1苏木化修饰水平,通过激光共聚集荧光显微镜观察BACE1和SUMO 1共定位。结果:同时转染BACE1、SUMO-1 UBC9在HEK293T或N2A-APP细胞,通过免疫共沉淀方法检测到BACE1和SUMO1结合,AAV-BACE1定位注射C57小鼠海马,也检测到在整体水平BACE1也可苏木化修饰。在转染了定点突变的BACE1K275R或K501R细胞株中,BACE1苏木化修饰水平较野生型显著降低,明确了K275和K501是BACE1苏木化修饰位点。我们观察到,在转染野生型或苏木化位点突变BACE1的N2A-APP细胞中,转染苏木化位点突变的细胞APP的剪切、Aβ40/42水平显著减少。我们还观察到苏木化位点的突变促进了 BACE1的降解,降低了其酶的活性,但不改变转录水平。免疫荧光结果显示:K501位点的BACE1的苏木化修饰可调控其亚细胞定位,提高其稳定性,并增加BACE1和APP的共定位。在小鼠海马CA1区定位注射AAV-Vector、AAV-BACE1野生型或苏木化位点突变病毒感染动物1个月后,与对照组相比BACE1野生型组产生更为严重的学习和记忆障碍,苏木化位点突变组较野生型组学习和记忆有显著改善。免疫荧光、免疫印迹、高尔基染色结果也显示,与对照组相比BACE1野生型组树突和树突棘密度以及突触相关蛋白表达量显著减少,但苏木化位点突变组较野生型组有显著改善。体外原代培养大鼠胚胎海马神经元发现,Aβ1-42可增加BACE1苏木化修饰水平,并呈浓度依赖性。在APP/PS1小鼠海马中,我们也观察到,随着年龄的增加,BACE1苏木化修饰水平也显著提高。结论:1.在细胞和整体水平BACE1可以被苏木化修饰,其修饰位点为K275和K501。2.BACE1苏木化修饰可以提高其蛋白稳定性和酶的活性。3.BACE1苏木化修饰增加APPβ的剪切和Aβ的生成。4.BACE1苏木化修饰加剧神经元树突损伤及学习记忆障碍。5.BACE1苏木化修饰水平与年龄存在相关性。阿尔茨海默病(AD)是最常见的神经退行性疾病,迄今为止,临床尚无理想的治疗药物。Terreterpenoid A和B,是从土曲霉获得的两种具有碳骨架的新型萜类化合物,其结构特征是壬烷碳骨架生物环[3.3.1]。通过X射线衍射技术鉴定了Terreterpenoid A的绝对结构,并通过电子圆二色性阐明Terreterpenoid B的绝对结构。能量共振转移技术(FRET)发现Terreterpenoid A和B可以显著降低β-分泌酶(BACE1)的活性,且IC50分别为78nM和59nM(阳性对照LY2811376 = 260nM,LY2811376是Ⅲ期临床试验中最有效的BACE1抑制剂之一)。在3 ×TgAPP/PS1/P301L小鼠侧脑室注射Terreterpenoid A后,BACE1的活性和Aβ42表达水平显著下降,树突棘密度和突触相关蛋白水平显著提高。另外,Terreterpenoid A明显改善3XTg模型鼠的学习记忆障碍。这些结果表明,Terreterpenoids A可作为研究开发AD治疗药物的一种潜在先导化合物。