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目的:观察GLP-1/GIP/Gcg三受体激动剂(Triagonist)对9月龄三转基因阿尔茨海默病(3xTg-AD)雌性小鼠认知行为和脑病理特征的影响,并探讨Triagonist发挥神经保护作用可能的信号转导机制。方法:选用9月龄的雌性APPSwe/PS1M146V/tau P301L 3xTg-AD小鼠和野生型C57BL/6J(C57)对照小鼠,随机分为四组,即:C57给生理盐水组(C57+NS)、C57给药组(C57+Triagonist)、3xTg-AD给生理盐水组(3xTg-AD+NS)和3xTg-AD给药组(3xTg-AD+Triagonist)。药物组中,Triagonist用生理盐水溶解,每天10 nmol/kg,经腹腔注入;生理盐水组以同样的体积和给药路径注入0.9%Na Cl。持续给药28天后开始行为学测试。(1)旷场实验将小鼠放入旷场中央,让其自由活动5 min,用摄像头记录小鼠的运动轨迹和5 min内小鼠运动的总距离,并计算小鼠在中间区域活动所占时间的百分比。(2)Y迷宫实验将小鼠放入Y迷宫的中央区域,让其自由活动8 min。记录8 min内小鼠的总进臂次数和进臂顺序,计算小鼠的自发交替正确率。(3)高架十字迷宫实验将小鼠面对闭臂放入中央区域后自由活动10 min,记录10min内小鼠的总进臂次数、进入开臂和闭臂的次数,计算小鼠进入开臂与闭臂的次数百分比。(4)经典Morris水迷宫和对位水迷宫将小鼠放于水迷宫中,分别进行定位航行、空间探索和可视平台实验。记录小鼠在1 min内的逃避潜伏期、目标象限中游泳时间和寻找可视平台的时间,并计算空间探索实验中在目标象限游泳的时间百分比。经典水迷宫实验后,将平台放入对位象限中,再次进行前述的定位航行实验和空间探索实验。(5)八臂迷宫将小鼠禁食24 h后,放入八臂迷宫的中央,令其自由探索10 min,进行适应和测试两个阶段,记录小鼠在测试阶段进入没有食物臂的次数(参考记忆错误)和再次进入食物臂的次数(工作记忆错误)。(6)悬尾实验将小鼠的尾部悬挂在特定白色盒子中,将摄像头尽可能的靠近小鼠,记录6 min内小鼠的不动时间。(7)强迫游泳实验将小鼠放入装有15 cm深自来水的透明圆筒中,让其活动6 min,记录小鼠后4 min的不动时间。(8)免疫组织化学实验小鼠行为学实验完成后,用水合氯醛腹腔麻醉,并灌注多聚甲醛,行30μm的冰冻切片后置于PBS中。加入BSA封闭,依次加入一抗、二抗和DAPI染色液,封片后在激光共聚焦显微镜下观察海马中Aβ斑块、磷酸化的tau蛋白、突触小泡蛋白(synaptophysin,SYP)和突触后致密物95(postsynaptic density 95,PSD95)的染色情况。(9)Western blot实验将行为学完成后的小鼠用水合氯醛麻醉、剪头、取脑、分离海马组织并提取蛋白、进行SDS-PAGE电泳,电泳完成后将蛋白转移到PVDF膜上。用5%胎牛血清(BSA)封闭2 h后分别加入一抗、二抗,最后加入ECL发光液进行曝光,运用Alpha View SA软件分析目的蛋白(SYP、PSD95、PKAc、PKA R2、p-CREB、t-CREB)的相对灰度值。(10)ELISA实验将上述提取的蛋白加入到已被c AMP单克隆抗体包被的微孔板中,按照ELISA试剂盒中的方法测定c AMP的含量。结果(1)旷场实验四组小鼠在5 min内的活动总距离和在中央区域的时间百分比均没有差异(P>0.05)。(2)Y迷宫实验3xTg-AD+NS组小鼠的自发交替正确率明显低于C57+NS组,且具有统计学差异(P<0.001);Triagonist治疗后,3xTg-AD小鼠的自发交替正确率明显增高(P<0.01);四组小鼠在8 min的总进臂次数没有差异(P>0.05)。(3)高架十字迷宫实验四组小鼠10 min内进入开臂的次数与进入闭臂的次数百分比没有统计学差异(P>0.05)。(4)经典Morris水迷宫和对位水迷宫四组小鼠在经典Morris水迷宫第1-5天的定位航行实验中,随着训练天数的增加,逃避潜伏期均有不同程度的减少;从第二天开始,3xTg-AD+NS组小鼠的逃避潜伏期与C57+NS组相比均有明显差异(P<0.01,P<0.001);从第三天开始,3xTg-AD+Triagonist组小鼠的逃避潜伏期与3xTg-AD+NS组小鼠相比明显减少(P<0.01)。第六天的空间探索实验中,3xTg-AD+NS组小鼠在目标象限的时间百分比明显少于C57+NS组(P<0.001);3xTg-AD+Triagonist组小鼠在目标象限的游泳时间百分比较3xTg-AD+NS组明显增多(P<0.001)。在可视平台实验中,四组寻找平台所用时间没有明显差异(P>0.05)。在对位水迷宫实验中,第1天(即总实验第7天)开始3xTg-AD+NS组的逃避潜伏期与C57+NS组相比已有明显差异(P<0.01,P<0.001),3xTg-AD+Triagonist组与3xTg-AD+NS组相比,也有统计学差异(P<0.05,P<0.001)。对位水迷宫定位航行试验结束后,进行空间探索试验。与C57+NS组相比,3xTg-AD+NS组小鼠在目标象限游泳的时间百分比明显减少(P<0.001);与3xTg-AD+NS组相比,3xTg-AD+Triagonist组则有所提高,且具有显著性差异(P<0.001)。(5)八臂迷宫实验八臂迷宫测试阶段,与C57+NS组相比,3xTg-AD+NS组小鼠在10天的平均工作记忆错误次数明显增多,具有显著性差异(P<0.001),给予3xTg-AD小鼠Triagonist后,平均工作错误次数明显减少(P<0.001);3xTg-AD+NS组小鼠在10天中的平均参考记忆错误次数与C57+NS相比也明显增多(P<0.01),3xTg-AD+Triagonist组小鼠的参考记忆错误次数与3xTg-AD+NS小鼠相比则明显减少(P<0.01)。(6)悬尾实验3xTg-AD+NS组小鼠不动时间百分比较C57+NS组小鼠明显增加(P<0.01);给予Triagonist后,3xTg-AD小鼠不动时间百分比没有明显变化(P>0.05)。(7)强迫游泳实验3xTg-AD+NS组小鼠与C57+NS组小鼠相比,其不动时间百分比明显较多(P<0.001);而3xTg-AD+Triagonist组小鼠的不动时间百分比与3xTg-AD+NS组相比没有明显差异(P>0.05)。(8)免疫组化实验3xTg-AD+NS组小鼠海马中的Aβ斑块和过度磷酸化的tau蛋白阳性表达量较C57+NS组小鼠明显增加(P<0.001);3xTg-AD+Triagonist与3xTg-AD+NS组比较阳性表达显著减少(P<0.001)。(9)Western blot实验与C57+NS组相比,3xTg-AD+NS组小鼠海马组织中的SYP、PSD95、PKAc、PKA R2以及p-CREB水平均发生了程度不等的下降(P<0.05,P<0.001)。经Triagonist处理后,这些蛋白分子的表达水平均有不同程度的恢复(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。(10)ELISA实验3xTg-AD+NS组小鼠海马组织中的c AMP表达水平明显低于C57+NS组(P<0.01);经Triagonist治疗后,给药组的3xTg-AD小鼠与3xTg-AD+NS组小鼠相比c AMP表达量明显增高(P<0.01)。结论(1)9月龄3xTg-AD雌性小鼠的空间工作记忆、参考记忆、再学习能力和认知灵活性均有损害,慢性给予Triagonist改善了以上认知功能。(2)9月龄3xTg-AD雌性小鼠的自主活动和探索能力并未损害,且没有表现出焦虑样症状,但有明显抑郁样行为;Triagonist并未影响以上功能。(3)给予Triagonist可以减轻9月龄3xTg-AD雌性小鼠海马组织中Aβ斑块聚集和tau蛋白过度磷酸化的病理特征;同时,Triagonist增加了与突触可塑性相关的突触前、后标志性蛋白SYP和PSD95的表达量。(4)Triagonist对3xTg-AD小鼠的神经保护作用可能与c AMP/PKA/CREB通路的激活有关。