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扁座壳孢是对环境友好的重要杀虫真菌,且具有较大的生防潜力。但是,在国内外却未有对扁座壳孢的遗传转化体系及转录组学方面的研究。在本研究中,我们开展了如下工作:(1)利用正交与响应面的方法优化扁座壳孢原生质体的制备条件,达到优化其遗传转化体系的目的;(2)为了探究扁座壳孢孢子(CO)、萌发(CG)、菌丝(HY)三个阶段与发育、致病等相关的表达差异基因,对三个阶段进行转录组测序。本研究结果如下:(1)利用正交和响应面的方法优化原生质体制备条件,得到制备扁座壳孢原生质体的最佳条件:0.7 mol/L的NaCl作为渗透压稳定剂,酶浓度为26.06 mg/mL,酶解时间为4.03 h,培养时间64.8 h,酶解温度为30℃,pH 6,制备的原生质体量可达4.41×107个/mL,原生质体量有明显的提高;最佳的再生蔗糖浓度为0.7 mol/L。通过实验发现,扁座壳孢原生质体再生可以被30 mg/mL草丁膦完全抑制,120 mg/mL草丁膦即可完全抑制扁座壳孢孢子的萌发,所以草丁膦草丁膦(phosphinothricin,PPT)可以作为扁座壳孢遗传转化时的选择压且其抗性基因为bar基因。利用扁座壳孢原生质体的转化,将PbarGPE质粒(带有bar基因)转化到扁座壳孢原生质体中,5代继代筛选后进行PCR验证,获得扁座壳孢原生质体转化的菌落为阳性。(2)对扁座壳孢菌孢子、萌发、菌丝三个不同发育阶段进行转录组测序,得到的 reads 数分别为 CO 18,557,966;CG 25,861,449;HY 15,738,191。CO 中碱基数为 3,748,397,642 bp,GC 含量为 55.4%,Q30 为 92.59;CG 中碱基数为5,223,059,508 bp,GC 含量为 55.88%,Q30 为 83.56;HY 中碱基数为 3,178,799,905 bp,GC 含量为 55.23%,Q30 为 92.46。通过差异基因的筛选,找到19个具有代表性的与扁座壳孢的发育、致病力相关的非常重要的基因。通过RT-qPCR得到以下结果:在CO阶段,6个基因(ao,wdr,hac1,cyp,ATP-syntH,βglu1)表达上调;在 HY 阶段,7 个基因(pksp,nak1,zeb1,bcyp,npr,slps,pep1)的表达量很高;另外,有 6 个基因(chit2,scd,acl,sh4,pr1c,pdhe1)在CG和HY阶段表达上调,尤其是CG阶段,表达量极高。基于以上基因的功能及其所在通路的研究,提出了扁座壳孢发育过程中可能包括的途径,包括了能量的产生、信号的传导、蛋白质的合成、细胞壁的合成、细胞分裂、细胞骨架合成、黄色色素和塔格糖等次级代谢产物的合成。而在致病基因方面主要发现两类:水解酶基因、免疫抵抗反应基因。而蛋白酶基因和几丁质酶为最主要的水解酶基因,mcl1基因为主要的免疫抵抗反应基因。据此,扁座壳孢原生质体遗传转化体系的建立并优化及得到的转录组信息和对其萌发、致病相关基因的研究,为后续重要基因的克隆表达及其功能的探究奠定了基础。