研究背景慢性肝脏疾病(Chronic liver disease)已成为一种全球性疾病,且近年其发病率呈逐渐增加的趋势。常见的慢性肝病包括肝炎相关慢性肝损伤,酒精性肝病,非酒精性脂肪肝病,自身免疫性肝病及药物损伤性肝病等。慢性肝病因长期的慢性肝损伤,进而引发肝脏的纤维化的发生。肝脏纤维化(Hepatic fibrosis)是肝脏在持续慢性损伤下是肝脏组织自我修复失衡的病理结果。严重的肝纤维化可导致肝硬化。肝硬化通常伴随肝组织内正常结构的紊乱和假小叶的形成。目前认为肝硬化是不可逆性的病变。随着肝硬化程度的加重可引发多种疾病,如由于门脉高压可引起上消化道的出血、脾功能亢进等;随着肝功能的失代偿可引起腹水、出血及感染等。其中,甚至报道有1-7%患者会发生癌变形成肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)。肝纤维化已经成为严重威胁国民健康的公共卫生问题。因此,了解肝脏纤维化发生的过程及其影响因素,是预防和治疗肝脏纤维化的有效方法之一。肝纤维化是肝脏持续的慢性损伤,引发持续的炎症反应进而导致组织内细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)过度沉积的结果。可引发纤维化的细胞包括:门脉周围的纤维母细胞,肌成纤维细胞及胆管内皮细胞等。其中,肝星状细胞(Hepatic stellate cell,HSC)被认为是产生细胞外基质引发纤维化的最主要细胞。静息状态下的肝星状细胞主要位于窦周间隙(即Disse space),功能主要为储存大量的类维生素A。慢性炎症状态下,肝星状细胞可被激活。激活肝星状细胞的因素很多,包括炎症细胞分泌的炎症因子,也包括来源于胃肠道的因素。活化的肝星状细胞主要表现为储存的类维生素A消失,产生纤维束等。同时,可分泌大量的炎症因子,包括巨噬细胞趋化因子(MCP-1),转化生长因子(TGF-β),肿瘤坏死因子(TNF-α)及白介素(IL-6)等。此外,激活的肝星状细胞还可产生大量的纤维性细胞外基质,主要成分包括胶原蛋白I、III和IV,纤连蛋白及层连蛋白等。当产生的细胞外基质大于溶解速度时,即可引发肝纤维化。因此,抑制肝星状细胞的活化和增殖有望成为抑制肝纤维化的有效方法。Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是先天性免疫系统中模式识别受体pattern recognition receptors,PRRs)家族的一员,可识别病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMP)和损伤相关分子模式(Damage-associated molecular pattern,DAMPs)。PAMP是先天性免疫系统通过模式识别受体(PRRs)识别结合的配体受体,主要是指病原微生物表面某些共有的高度保守的分子结构,如G~-菌的脂多糖。其激活的下游可提供宿主识别和阻止先天性免疫系统的超活化。尽管TLRs可以识别PAMP,进而阻止侵入的病原。然而报道称TLRs同时促进了适应性免疫应答,表皮再生,肿瘤发生及非细菌性炎症等。由于肝脏内持续大量表达TLRs,因此近年已有报道称TLRs在肝脏内发挥主要的免疫应答。但是,由于肝脏本身的耐受能力,在正常肝脏中,TLRs很少被激活。而当肝纤维化甚至肝硬化时,因门脉高压引发的肠道微生物群紊乱及因门脉高压引起的肠粘膜屏障功能减弱。大量的内毒素(lipopolysaccharide,LPS)可经胃肠道被吸收入血,后经门静脉进入肝脏。LPS,位于G-杆菌的细胞质内,TLR4可被其特异性激活。报道称,LPS可通过TLR4途径激活肝星状细胞,进而加重肝纤维化。而且这一机制适用于包括病毒性肝炎,酒精性肝炎,药物性肝炎及非酒精性脂肪肝等慢性肝病。激活的TLRs可引发下游包括骨髓分化初反应蛋白88(Myd88),Toll/白介素-1受体(Toll/interleukin(IL)-1 receptor,TIR)区域包含干扰素β的配体(containing adaptor-inducing interferon-β)和TRIF相关配体分子(TRIF-related adaptor molecule,TRAM)。其进一步引发包括核因子-kB(Nuclear factor-kB,NF-kB)干扰素应答因子(Interferon response factors,IRFs)及丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein(MAP)kinases)的激活,继而调节转录和翻译。包括调节IL-6,IL-12,IL-23及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等促炎因子的分泌。因此调控TLRs也被认为是有效的抗纤维化方法之一。早期人们认为肝纤维化及肝硬化是不可逆的过程。随着近几年对肝纤维化及肝硬化的研究深入,已有实验研究表明肝硬化是可逆的,可以治愈的。然而,这必须去除损伤因素。而这尤其在我国很难达到。同时,治疗肝纤维化的药物都还处于实验动物阶段,目前临床上并没有有效的抗纤维化药物。八宝丹是国家重要保护的中药保密品种,是中国食品药品监督管理局(Chinese Food and Drug Administration,CFDA)规定允许使用天然麝香的特效药、关键药之一。八宝丹的主要成分包括天然牛黄、蛇胆、珍珠、羚羊角、麝香、三七等八味天然中药。目前已获得国家食品药品管理局认证,作为保肝药用于临床。然而,其是否可用于治疗肝纤维化及其可能作用机制是什么,目前依然不清楚。研究目的本实验旨在观察中药八宝丹对二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine,DEN)诱导的大鼠慢性肝损伤的影响;进而探究其可能作用机制。研究方法首先建立模型:在大鼠饮水中将DEN按照1:50,000(v/v)混入,进而诱导大鼠肝纤维化模型。同时将八宝丹用生理盐水稀释,按0.5g/kg体重通过灌胃方式处理大鼠。8周后处死大鼠,取血取肝用于后续实验分析。然后检测八宝丹对肝损伤的保护作用:通过血清学分析肝脏损伤的指标谷丙转氨酶和谷草转氨酶以检验八宝丹对肝脏的保护作用;然后通过肝组织HE染色,并通过RT-PCR和ELISA实验,以检测肝组织炎症情况;随后观察八宝丹对肝纤维化得影响:通肝组织免疫组织化学染色检测纤维化标志物(α-SMA)的表达情况,同时检测肝组织内胶原蛋白的表达情况,另外检测纤维化主要组成氨基酸-羟脯胺酸的表达情况。并通过苏木素-天狼星红进一步验证纤维化表达的差异情况。进而探究八宝丹作用机制:通过组织染色明确TLR4表达的差异,进而分离原代肝星状细胞,用脂多糖(LPS)激活,同时用八宝丹大鼠血清处理,观察对纤维细胞活化的影响。并进一步检测相关信号,明确其作用机制。研究结果1.DEN可显著引发肝脏的损伤,而同时给予八宝丹的大鼠肝功能较单纯DEN组显著减轻;2.DEN可诱发大鼠肝内炎症细胞浸润及炎症因子表达增大;而同时给予八宝丹可显著降低炎症细胞浸润及炎症银子的表达;3.同时给予八宝丹组大鼠肝内纤维胶原及细胞外基质沉积显著减轻;4.八宝丹可抑制DEN诱导产生的TLR4的激活;5.体外原代细胞培养及处理表明八宝丹可抑制LPS诱导的纤维细胞的活化及增值;6.随后通过检测TLR4下游基因的表达,表明八宝丹可通过抑制TLR4信号途径发挥作用。结论八宝丹对肝脏损伤有保护作用,且可明显降低肝脏的纤维化程度,表明八宝丹是潜在的抗纤维化药物。同时,进一步研究表明,八宝丹可通过抑制TLR4信号通路发挥作用。