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第一部分乳腺癌组织中肿瘤相关巨噬细胞COX-2的表达及临床意义目的:通过乳腺组织芯片,检测乳腺癌组织中肿瘤相关巨噬细胞(TAM)内环氧化酶2(COX-2)蛋白表达水平,并分析其与乳腺癌临床数据之间的相关性。方法:本实验采用免疫组织荧光双染法,检测乳腺癌组织芯片(含160例乳腺癌组织及10例癌旁乳腺组织)中的TAM(CD163标记)、以及TAM中COX-2的表达情况。并用皮尔森相关系数分析COX-2+TAM与Ki67在临床标本中表达的相关性, Kaplan-Meier生存分析用于评价COX-2+TAM对总体生存率的影响;多变量Cox回归模型用于分析上述预后影响因素的风险比和独立性。结果:乳腺癌组织中COX-2+TAM单位面积平均光密度值为13.59±10.51mm-2,而其在癌旁组织中为1.56±1.27mm-2,两者比较差异有统计学意义(t=13.02,p<0.001);COX-2+TAM高表达组(大于平均光密度值)在临床分期Ⅲ期、组织学Ⅱ-Ⅲ级、淋巴结转移以及Ki67阳性表达中的数量明显高于COX-2+TAMs低表达组(p值分别为<0.001,0.024,0.021,0.03),而两组在患者年龄、肿瘤大小以及乳腺癌分子分型中的数量无显著性差异(p>0.05);此外,COX-2+TAMs与Ki67表达呈正相关性(r=0.449,p<0.001);COX-2+TAM的高表达可显著降低患者10年总体生存率(p=0.002),对5年总体生存率无明显影响(p=0.099),Cox多元回归分析显示其可作为乳腺癌独立预测因子之一(HR=2.085, p=0.036)。结论:临床相关性分析提示,TAM中过表达COX-2与乳腺癌的恶性进程密切相关,可作为乳腺癌不良预后的独立预测指标。第二部分肿瘤相关巨噬细胞过表达COX-2对乳腺癌增殖及侵袭能力的影响目的:探讨TAM过表达COX-2对乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。方法:体外刺激人单核细胞株THP-1细胞贴壁成为巨噬细胞,并诱导其成为TAM。利用腺病毒载体系统上调或下调TAM中COX-2基因的表达。将单独培养、与过表达或靶向沉默COX-2基因的TAM共培养后的MDA-MB-231及MCF-7细胞进行平板克隆形成和CCK-8实验以测定各组增殖情况;细胞划痕实验和Transwell小室迁移侵袭装置测定乳腺癌细胞迁移、侵袭能力的改变。体内实验部分采用不同处理的人乳腺癌细胞株MCF-7对BABL/c雌性裸鼠进行异种移植,观测各组移植瘤瘤重的情况。结果:与TAM共培养组的MDA-MB-231及MCF-7细胞增殖率、迁移率和侵袭率较单独培养组明显增加,过表达COX-2的TAM对乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力较前两组进一步提升,差异有统计学意义。下调TAM中COX-2基因的表达后,能明显抑制TAM对肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭的促进作用。体内实验中,异种移植瘤的重量在单独培养组、TAM共培养组、TAM过表达COX-2组依次增加;TAM中COX-2基因表达下调后,异种移植瘤重量较TAM共培养组明显降低,差异有统计学意义。结论:TAM过表达COX-2能增强乳腺癌细胞的生长增殖、迁移侵袭能力。第三部分TAM过表达COX-2介导乳腺癌增殖及侵袭转移的分子机制研究目的:探讨和分析相关信号通路对TAM过表达COX-2介导乳腺癌增殖转移中的作用及分子机制。方法:Western-blot分析PI3K/Akt及ERK信号通路在不同条件下乳腺癌细胞中的表达激活情况;免疫组化分析p-Akt、p-ERK在异种移植瘤组织中表达及分布情况;使用PI3K/Akt通路抑制剂wortmannin抑制PI3K/Akt通路,Ras-MAPK通路抑制剂U0126抑制ERK表达后进行CCK-8法测定各组细胞增殖情况,Transwell小室转移侵袭实验测定细胞侵袭能力。结果:western blot结果显示,与单独培养组相比,与TAM共培养的乳腺癌细胞中p-Akt及p-ERK表达明显增加,TAM过表达COX-2可较前两组进一步增强两条信号通路的激活,而下调TAM中COX-2基因表达则会明显逆转此现象(p<0.01);相同的结果也在乳腺癌裸鼠模型中获得,在TAM过表达COX-2的异种移植瘤组织中,p-AKt及p-ERK的阳性染色率高于TAM共培养组和单独培养组,下调TAM中COX-2基因表达,p-AKt及p-ERK的阳性染色率明显降低,差异有统计学意义(p<0.01)。加入PI3K/Akt通路抑制剂wortmannin或Ras-MAPK通路抑制剂U0126可分别抑制TAM过表达COX-2对乳腺癌细胞PI3K/Akt及ERK通路的激活,同时逆转TAM过表达COX-2对乳腺癌细胞增殖及侵袭能力的促进作用。结论:TAM可通过过表达COX-2,进而激活乳腺癌细胞中PI3K/Akt以及ERK通路,发挥促肿瘤增殖及侵袭能力的作用。