论文部分内容阅读
目的:骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是青少年最常见的恶性骨肿瘤,全世界的发病率约0.0004%。骨肉瘤的发生与多种micro RNAs(mi RNAs)的异常表达相关。外泌体(Exosome,Exos)mi RNAs在细胞间通讯中受到越来越多的关注。肿瘤来源的外泌体可以促进肿瘤细胞的生长及其肿瘤血管生成。mi R-1307已被发现在多种肿瘤中异常表达,但其在骨肉瘤中的研究迄今为止没有相关报道。本研究旨在检测骨肉瘤来源的外泌体mi R-1307对骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。方法:购买人骨肉瘤细胞系(U2OS、HOS、SW1353、Saos-2和143B)和人正常成骨h FOB 1.19细胞系。培养SW1353骨肉瘤细胞和h FOB 1.19正常成骨细胞,通过差速离心法提取骨肉瘤外泌体(OS-Exos)和正常成骨细胞外泌体(h FOB 1.19-Exos)。透射式电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)和纳米粒子追踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)验证所分离的细胞外颗粒是否为外泌体。CCK-8实验观察加入骨肉瘤外泌体后骨肉瘤细胞在不同时间(0h、24h、48h和72h)的细胞增殖情况,流式细胞术(Flow Cytometry)检测骨肉瘤细胞的凋亡水平,Transwell实验检测骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力。通过实时荧光定量PCR(q RTPCR)实验检测mi R-1307在5种不同骨肉瘤细胞系、h FOB 1.19正常成骨细胞系和骨肉瘤外泌体中的表达水平。其次,下调骨肉瘤外泌体中的mi R-1307,然后再观察骨肉瘤外泌体对骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡水平的影响。使用Targetscan、mi RDB和mi RDIP数据库在线预测mi R-1307的靶基因可能为AGAP1。q RT-PCR和Western blot(WB)技术检测过表达mi R-1307后对AGAP1的m RNA和蛋白表达水平的影响,并检测AGAP1在骨肉瘤细胞中m RNA和蛋白的表达水平。通过荧光素酶报告基因技术检测进一步确定mi R-1307是否与AGAP1的3′-UTR相结合。最后,骨肉瘤细胞转染mi R-NC mimics、mi R-1307 mimics或mi R-1307 mimics+AGAP1后检测其对骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡水平的影响。结果:1、透射式电子显微镜(TEM)显示所提取的细胞外颗粒形状为圆形囊泡与双层膜样结构;纳米粒子追踪分析(NTA)提示所提取的细胞外颗粒的直径范围在30nm到150nm之间,表明所提取的细胞外颗粒为外泌体。2、CCK-8实验结果表明骨肉瘤外泌体明显促进骨肉瘤细胞的增殖能力;Transwell实验结果表明,骨肉瘤外泌体与正常对照组相比明显促进骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力;流式细胞术检测结果提示,经骨肉瘤外泌体处理的骨肉瘤细胞与对照组相比,其凋亡细胞数量明显减少。3、q RTPCR结果表明mi R-1307在5种骨肉瘤细胞系及骨肉瘤外泌体中的表达水平均明显高于对照组;培养骨肉瘤细胞并转染mi R-1307 inhibitor后提取骨肉瘤外泌体,与对照组相比,转染mi R-1307 inhibitor后骨肉瘤外泌体中的mi R-1307水平明显降低;转染mi R-1307 inhibitor后,骨肉瘤外泌体对骨肉瘤细胞的迁移、侵袭和增殖能力明显下降,然而其凋亡水平明显升高。4、Targetscan、mi RDB和mi RDIP数据库在线预测分析发现,AGAP1的3′-UTR的其中一段序列与mi R-1307互补,并且两者的结合评分在所预测靶点中最高。5、骨肉瘤细胞转染mi R-1307 mimics后,AGAP1的m RNA水平和蛋白水平均明显下调;5种骨肉瘤细胞系中AGAP1的m RNA表达水平均明显低于h FOB1.19细胞系;SW1353骨肉瘤细胞中AGAP1的蛋白水平明显低于对照组,结果表明AGAP1可能是骨肉瘤的潜在治疗靶点。6、荧光素酶检测结果显示,mi R-1307明显抑制野生型PGLO‐AGAP1-WT 3′-UTR的活性,然而,mi R-1307对PGLO‐AGAP1-MUT 3′-UTR突变组荧光素酶的活性无明显抑制作用,以上数据表明,mi R-1307与AGAP1的3′-UTR直接结合,从而抑制AGAP1的m RNA和蛋白水平。7、与正常对照相比,骨肉瘤细胞转染mi R-1307 mimics后,明显促进了骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力,却明显抑制了其凋亡水平,然而,补充AGAP1后,mi R-1307对骨肉瘤细胞的调控能力受到明显的抑制。结论:1、骨肉瘤外泌体明显促进骨肉瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和抑制骨肉瘤细胞的凋亡。2、mi R-1307在骨肉瘤细胞及骨肉瘤外泌体中均明显高表达,下调骨肉瘤外泌体中mi R-1307后,骨肉瘤外泌体对骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的作用也明显下降。3、mi R-1307与AGAP1的3′-UTR直接结合,从而抑制AGAP1的m RNA和蛋白水平。4、AGAP1在骨肉瘤细胞中明显低表达。5、mi R-1307可以明显促进骨肉瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和抑制骨肉瘤细胞的凋亡,而过表达AGAP1可以抑制mi R-1307的上述调控作用,其可作为骨肉瘤的潜在治疗靶点。综上,骨肉瘤外泌体mi R-1307靶向AGAP1促进骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭和抑制凋亡。