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JMJD3（Jumonji domain-containing protein 3）又称赖氨酸特异性去甲基化酶6B（KDM6B）,是一种可诱导表达的组蛋白去甲基化酶,参与多种生物学过程并在其中发挥重要作用。JMJD3可通过影响H3K27的甲基化或通过直接结合到特定细胞因子启动子上调控炎性因子的表达,从而参与炎性反应调控。兽医临床上,病原微生物感染往往伴随有剧烈的炎性反应,JMJD3是否在其中起着重要的作用还未见报道。此外,猪JMJD3的表达特性、去甲基化酶功能以及在炎性反应中的作用还未鉴定。目的本研究聚焦于猪JMJD3分子:⑴鉴定猪JMJD3的表达特征;⑵分析猪JMJD3介导的组蛋白去甲基化作用;⑶以LPS诱导的猪肺泡巨噬细胞的炎性反应为模型,探讨猪JMJD3对炎性因子的表达调控作用。方法⑴猪JMJD3基因全长编码序列的克隆:根据NCBI上预测的猪JMJD3基因序列（序列号XM021067833.1）,设计引物,预测CDS长4938 bp,采用分段的方法克隆。提取猪肺组织RNA反转录后扩增JMJD3不同片段,克隆至p MD18-T载体中进行测序鉴定,RACE法对5’端进行克隆测序,利用相关软件拼接各段序列获得JMJD3的全长编码序列。利用相关生物信息学软件、网站对猪JMJD3分子的基因序列、氨基酸序列进行分析。⑵真核表达质粒的构建及多克隆抗体的制备:根据猪JMJD3编码区的基因序列设计引物,以克隆质粒p UC57-JMJD3为模板,利用PCR扩增获得猪JMJD3基因ORF,通过酶切、连接等方法将该基因克隆至真核表达载体p3x Flag-CMV-14中,构建的重组质粒命名为Flag-JMJD3,利用脂质体法将该质粒转染293T和PIEC细胞,通过Western blot、间接免疫荧光检测Flag-JMJD3的表达;根据预测的抗原肽人工合成多肽,与钥孔血蓝蛋白（KLH,keyhole limpet hemocyanin）交联后免疫大白兔,制备多抗血清,通过Western blot验证多抗的特异性。⑶组蛋白去甲基化功能鉴定:将真核表达质粒Flag-JMJD3转染PIEC细胞,通过间接免疫荧光检测Flag-JMJD3过表达后H3K27me3、H3K27me2、H3K27me1、H3K4me3、H3K9me3、H3K36me3的甲基化情况,对其去甲基化功能进行鉴定分析。⑷对炎性因子表达调控的研究:分离正常猪肺泡巨噬细胞,LPS刺激后利用RT-q PCR、Western blot检测JMJD3表达情况,通过RNAi沉默肺泡巨噬细胞中JMJD3的表达,RT-q PCR检测LPS刺激后炎性因子的转录情况,通过GSK-J4抑制剂抑制JMJD3的去甲基化酶活性后,RT-q PCR检测LPS刺激后炎性因子的转录情况,PIEC细胞过表达JMJD3后检测其对炎性因子转录的影响,从而对JMJD3在炎性调控中的作用进行分析。结果⑴成功克隆了猪JMJD3基因的全长编码序列,大小为4926 bp,编码1641个氨基酸,相关生物信息学分析显示,猪的JMJD3分子在C-端存在该家族特征性的Jmj C结构域,与其他哺乳动物相比该结构域序列非常保守,仅存在一个氨基酸的突变。⑵成功构建了Flag-JMJD3真核表达质粒,Western blot结果显示,抗Flag抗体可以识别真核表达的Flag-JMJD3融合蛋白,约200 k Da,间接免疫荧光分析,猪JMJD3主要定位于细胞核;成功制备了抗猪JMJD3分子的多克隆抗体,Western blot结果显示该抗体可以特异性识别猪的JMJD3分子,也能与人源的JMJD3分子发生反应。⑶PIEC细胞系过表达Flag-JMJD3后,检测到H3K27me3、H3K27me2、H3K27me1发生不同程度的下降,而H3K4me3、H3K9me3、H3K36me3无明显变化。⑷RNAi和抑制剂GSK-J4可以显著抑制LPS诱导的猪肺泡巨噬细胞中IL-1β和CXCL10的转录上调,PIEC细胞系过表达JMJD3可以显著促进IL-1β和CXCL10转录上调。结论成功克隆了猪JMJD3基因的全长编码序列,构建了其真核表达质粒进行真核表达,制备了抗猪JMJD3分子的多克隆抗体,对该分子的去甲基化酶功能进行了分析并初步探索了其对炎性因子表达调控的作用。本研究显示,猪的JMJD3分子具有H3K27去甲基化酶活性,并且可以参与LPS诱导的炎性反应调控,是一种参与炎性反应调控的因子。揭示了猪JMJD3对炎性反应的调控作用和潜在机制,为进一步研究该分子在猪疫病中的潜在作用奠定了基础。