哺乳动物精子发生的研究已成为当今生殖生物学领域中的一个热点,并取得了很大的进展。但目前关于精原干细胞自我更新及分化的分子机制及有关信号通路、生精细胞减数分裂后的精子成熟机制等仍需深入研究,而且精子细胞分化为成熟精子的体外试验至今也未见报道。生殖细胞体外培养技术的发展则为这些问题的解决提供了可能。研究者可直接对所培养的各级生精细胞进行观察、处理及分析,进而在体外研究精子发生过程的相关机制及其中起作用的因子和基因等。因而建立稳定有效的生殖细胞培养系统是非常必要的。本研究初步建立了绵羊雄性生殖细胞体外共培养系统,同时为从分子水平对共培养系统中各级生殖细胞的存活进行检测,首次成功克隆了绵羊各级生殖细胞的特异标记基因,如E型钙粘连蛋白基因(E-cadherin gene,cdh1)、联会复合体蛋白3基因(synaptonemal complex protein-3 gene,scp3)、过渡蛋白1基因(Transition protein-1 gene,tnp1)和过渡蛋白2基因(Transition protein-2 gene,tnp2),并利用得到的cDNA序列进行引物设计,用于转录表达分析来鉴定绵羊生殖细胞共培养系统中的各级生殖细胞。另外构建了精原干细胞的特异表达基因cdh1部分编码序列的原核表达载体,制备了CDH1抗原表位蛋白,以期制备多克隆抗体,为今后精原干细胞的研究提供细胞表面标记,从而为将来绵羊精原干细胞的相关研究奠定基础。1、绵羊cdh1、scp3、tnp1和tnp2基因的克隆本研究成功克隆了绵羊cdh1、scp3、tnp1和tnp2基因,分别获得了2799bp、855bp、246bp和340bp的cDNA序列,其中cdh1、scp3和tnp1分别获得了2652bp、708bp和168bp的全部编码区序列,tnp2基因得到了340bp的部分编码区序列。序列分析表明,在进化水平上cdh1、scp3和tnp1高度保守,而tnp2也具有较高的保守性。2、绵羊雄性生殖细胞体外共培养体系的初步建立及鉴定本研究首次建立了绵羊雄性生殖细胞体外共培养体系。采用绵羊睾丸组织块培养法,将4月龄的绵羊睾丸组织,在无菌条件下,用含10%灭活的标准胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养液进行培养。在培养1～2周后,可观察到从曲细精管中游离出的支持细胞贴壁生长;生殖细胞或贴壁生长,或在贴壁细胞表面运动。从共生细胞培养两周开始,能一直观察到精母细胞和精子细胞,说明共生培养过程中精原干细胞不断地分化为精母细胞和精子细胞。此培养系统不需外加生长因子,在含10%FBS培养液中,精原干细胞、精母细胞、圆形精子细胞和支持细胞可长期共生达10周以上。特异标记基因的转录表达分析结果显示在体外培养长达10周后,仍能检测到cdh1、scp3、tnp2、wt1和gapdh的转录表达,表明了此培养系统的生殖细胞在支持细胞的滋养下可在体外环境下持续地进行精子发生的过程。这一结果进一步弥补了形态学观察上的不足,表明了组织块和共生的支持细胞为生殖细胞的增殖和分化提供了营养因子和调节因子。3、绵羊cdh1基因原核表达载体的构建及CDH1多肽抗原的制备为了鉴定绵羊生殖细胞中的精原干细胞,本研究在原核表达系统中表达和纯化制备了CDH1抗原表位蛋白。采用PCR方法扩增得到cdh1目的片段,经双酶切回收目的片段后,将其与原核表达载体pET-44a(+)连接,转入E.coliBL21(DE3)中诱导表达,通过Ni-NTA树脂亲和层析柱进行蛋白的分离纯化,Western blot鉴定纯化蛋白。结果表明本研究成功构建了重组表达载体pET-44a(+)-CDH1,且目的蛋白在E.coli BL21(DE3)中高效表达,最高表达量约为细菌总蛋白的22%,并成功的获得了纯化的目的蛋白。这为将来制备抗体,开展绵羊精原干细胞的相关研究打下基础。