支原体(Mycoplasma)是一类介于病毒和细菌之间能在细胞外繁殖的最小的原核生物，解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum，Uu)为支原体科、脲原体属中主要微生物之一，是一类缺乏细胞壁、需甾醇并可分解尿素的兼性厌氧微生物，可分为2个群(Parvo生物群和T960生物群)共14个血清型。Uu常可在男性和女性泌尿生殖道中检出，既往研究表明，其与非淋菌性尿道炎(Nongonococcal urethritis，NGU)、黏液脓性宫颈炎(Mucopurμlent cervicitis,MPC)、慢性前列腺炎、附睾炎、不孕不育等多种泌尿生殖道疾病高度相关。由于无细胞壁结构，Uu对作用于细胞壁合成的抗菌药物天然耐药，而对干扰蛋白质合成及DNA复制的药物敏感。Uu对青霉素类、β-内酰胺类、万古霉素等完全不敏感，对多粘菌素、利福平、磺胺类药物普遍耐药，对支原体最有抑制活性的抗菌药物是四环素类、大环内酯类及喹诺酮类。大环内酯类抗菌素是治疗Uu感染一线药物之一，在妊娠和儿童感染中，大环内酯类抗菌素是治疗Uu感染唯一推荐使用的药物。近来国内外研究表明，Uu对上述三类抗菌药物的已有较高耐药，尤以大环内酯类耐药形势严峻。目前，Uu对四环素类、喹诺酮类抗菌药物的耐药机制已基本明确，并已发展出相应的检测方法，而Uu对大环内酯类抗菌素的耐药机制国内外至今仍未有深入的研究。 对大环内酯类耐药的细菌中，其耐药机制主要有大环内酯类作用靶位点改变、药物主动外排、抗菌素灭活酶的产生三种，23sRNA V区2063、2064位点突变是引起肺炎支原体对大环内酯类耐药丰要机制，人型支原体对红霉素、阿奇霉素天然耐药，主要为23SrRNA 2611位天然突变，其他对大环内酯类耐药的机制还有23SrRNA的2586、2576、和2056位点的突变，可能存在药物外排系统。 本研究通过PCR测序方法检测Uu红霉素耐药菌株23SrRNA的V区上热点突变，并应用特异性PCR方法检测甲基化酶、多种外排泵等可能的耐药基因，首次应用分子牛物学方法探索Uu对红霉素耐药的主要分子机制：并对Uu菌株进行分群研究，探讨Uu两群之间对红霉素的耐药机制之间差异，以发现耐药机制的规律，并进一步探讨临床耐药菌株耐药机制监测方法，对指导临床用药、监测及控制耐药形势的发展均有重要意义。 方法： 1.收集临床菌株73株及1～14型血清型Uu标准菌株，进行培养鉴定及分子生物学鉴定。 2.各菌株行红霉素标准药物的体外药敏实验，分成临床耐药菌株、临床敏感菌株、标准菌株组。按CLSI及参考相关文献，制定本研究中红霉素≥8μg/ml为耐药菌株。 3.对各菌株行PCR分群，分成Parvo和T960两个生物群，结合体外药物敏感实验，把两群临床耐药菌株再各自分为高、中、低浓度耐药三组，在两群临床敏感菌株中各自随机抽取5株作为临床敏感株对照组，标准菌株组同样进行PCR分群及体外药物敏感试验作为标准对照。 4.对三组菌株进行Uu红霉素耐药23SrRNA V区热点突变的检测：设计Uu23SrRNAV区热点突变区特异性引物，用PCR法扩增热点突变区片段并进行全自动测序获得热点突变区序列，与相应标准菌株序列对比，发现可能存在的热点突变位点。 5.对三组菌株进行Uu红霉素耐药的常见erm甲基化酶基因的检测：应用ermA、ermB、ermC特异性引物，用PCR法检测Uu临床耐药组、临床敏感组及标准菌株组是否存在相应甲基化酶耐药基因。 6、对三组菌株进行Uu红霉素耐药的常见外排泵(mefA/E、msrA/B、mreA)的检测：应用mefA/E、msrA/B、mreA特异性引物，用PCR法检测Uu临床耐药组、临床敏感组及标准菌株组是否存在相应甲基化酶耐药基因。 7.综合分析耐药基因的检出及其与生物群别、耐药浓度等关系，明确Uu可能的耐药机制及耐药规律，并分析其临床意义。 结果： 1.73株临床菌株经培养鉴定及分子牛物学鉴定均符合Uu特征，经体外药物敏感试验及PCR分群，得耐药菌株35株(47.95％)，其中Parvo生物群17株，T960生物群18株。 2.临床耐药菌株组发现含ermB耐药基因(占54.29％)及msrA/B耐药基因(25.71％)，以ermB耐药基因为主(p=0.0273)；同时含有ermB和msrA/B耐药基因2株(占5.71％)，未发现23SrRNA的V区点突变及ermA、ermC、mefA/E、mreA等其他可转移耐药基因，总耐药基因发现率74.29％。临床敏感菌株组及标准菌株组均未发现23SrRNA的V区点突变及可转移耐药基因的阳性扩增。 3.临床耐药菌株组Parvo生物群同时发现ermB及msrA/B两种耐药基因，两者分布无统计学差异(p=1.0)；T960生物群发现的耐药基因只有ermB，未发现msrA/B耐药基因，两者发现比率差异有统计学意义(p=0.0003)。msrA/B耐药基因在Parvo生物群及T960生物群两个生物群发现差异有统计学意义(p=0.0003)。 4.ermB基因和msrA/B基因临床耐药组菌株高中低各浓度组的分布无统计学差异。分群后两种耐药基因在各耐药浓度上的分布差异也无统计学意义。同时含有ermB和msrA/B耐药基因位于Parvo生物群中度耐药浓度组。 5.结合分群和耐药浓度，msrA/B在中度耐药浓度组两群间分布有统计学差异(p=0.0256)，在高度及低度耐药浓度组差异无统计学意义，ermB在各耐药浓度组两群间分布均无统计学差异。 结论： 1.Uu对红霉素的丰要耐药机制有甲基化酶机制(以ermB为主)和外排泵机制(以msrA/B为主)，未发现23SrRNA的v区常见热点突变及ermA、ermC、mefA/E、mreA耐药基因。 2.Parvo生物群存在ermB和msrA/B两种耐药机制，而T960牛物群以ermB耐药机制为主，未发现msrA/B。msrA/B可能倾向于发生在Parvo牛物群菌株中。 3.ermB和msrA/B耐药基因可同时存在于同一耐药菌株中。