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研究目的：探讨华支睾吸虫乳酸脱氢酶做为药物靶标分子的机制。在蛋白定位的基础上研究吡喹酮、左旋咪唑、阿苯达唑、芬苯达唑、甲苯咪唑等药物对重组的CsLDH酶促功能的影响，期望了解这些药物的分子作用机制。
研究方法
1、华支睾吸虫乳酸脱氢酶(CsLDH)基因的生物信息学分析
应用在线核酸蛋白分析工具以及专门的生物信息学应用软件中相关程序(如：BLASTx程序、Translation程序和Alignx程序等等)对CsLDH和其他物种LDH序列进行同源比对，分析该蛋白的拓扑结构、抗原表位、功能域、分子进化关系以及蛋白质的三级结构，进而预测其生物学功能。
2、华支睾吸虫乳酸脱氢酶(CsLDH)定位及结构研究
2.1华支睾吸虫乳酸脱氢酶(CsLDH)亚细胞及虫体组织定位
2.1.1 CsLDH的真核克隆、表达和鉴定
从cDNA文库当中扩增出CsLDH基因，应用分子克隆技术构建pEGFP-N1-CsLDH真核表达质粒。脂质体法将重组质粒转染HeLa细胞，用倒置荧光显微镜观察培养24h和72h蛋白的表达，比较其与对照载体pEGFP-N1表达的差异。以RT-PCR鉴定转染pEGFP-N1-CsLDH质粒的HeLa细胞中CsLDH基因在mRNA水平的表达。
2.1.2 GFP-CsLDH亚细胞定位转染
pEGFP-N1-CsLDH重组质粒的HeLa细胞常规培养24h后，一抗用CsLDH免疫兔血清，二抗用橙色荧光Cy3羊抗兔IgG(H+L)，免疫细胞化学法间接检测CsLDH在HeLa中的定位。
2.1.3 CsLDH的免疫组织定位
解剖感染华支睾吸虫的猫，将在新鲜猫肝中的华支睾吸虫成虫分离、固定后用石蜡包埋切片。一抗用CsLDH免疫兔血清，二抗用橙色荧光Cy3羊抗兔IgG(H+L)，免疫荧光组织化学法间接法检测CsLDH在华支睾吸虫虫体的定位。
2.2 CsLDH拓扑结构研究
2.2.1 E10-20及E94-102表位克隆表达和纯化
合成E10-20及E94-102各自对应的正反两条DNA链，退火后获得酶切后的目的片段。将经分子克隆技术获得构建的pGEX-4T-1-E10-20及pGEX-4T-1-E94-102重组质粒，进行原核表达，SDS-PAGE鉴定表达的重组蛋白，上清液经亲和层析纯化，获得目的蛋自。
2.2.3 CsLDH免疫血清
E10-20和E94-102的免疫反应性检测；E10-20和E94-102免疫血清与CsLDH的免疫反应性检测分别将与E10-20、E94-102和CsLDH免疫SD大鼠获得免疫血清，以Western blotting和间接ELISA法检测CsLDH免疫血清对E10-20和E94-102的识别；同法检测E10-20和E94-102的免疫血清对CsLDH蛋白的识别。
2.2.4 E10-20、E94-102与CsLDH免疫血清对CsLDH催化丙酮酸还原成乳酸的影响
在标准酶活性反应体系中，加入不同稀释度的E10-20、E94-102与CsLDH免疫血清，对重组CsLDH催化丙酮酸还原成乳酸的酶活性进行测定，计算不同稀释度血清对重组CsLDH活性的影响。
2.2.5鉴定E10-20和E94-102在华支睾吸虫成虫定位解剖感染华支睾吸虫的猫，将在新鲜猫肝中的华支睾吸虫成虫分离、固定后用石蜡包埋切片，一抗用E10-20和E94-102免疫大鼠血清，二抗用橙色荧光AlexaFluor@555羊抗大鼠IgG(H+L)，免疫荧光组织化学法间接检测E10-20和E94-102在华支睾吸虫成虫组织中的定位。
3、抗吸虫药物对于重组CsLDH作用研究
在标准的酶活性反应体系中，加入不同浓度的吡喹酮、左旋咪唑、阿苯达唑、芬苯达唑和甲苯咪唑，对重组CsLDH催化的丙酮酸还原及乳酸氧化反应的酶活性进行测定，设不同药物对应的溶剂作为对照，计算不同药物浓度作用下NADH在340nm处吸光度的变化，SPSS 16.0对实验数据进行分析。
研究结果
1、华支睾吸虫乳酸脱氢酶(CsLDH)基因的生物信息学分析
Blastx分析该基因为全长基因，ORF从第79位到1062位含有984bp，编码328aa，理论分子量为35.6kDa。蛋白质序列与其他物种的LDH进行多重序列比对，发现其与SjLDH的一致性最高，达74％。蛋白质序列含有其他物种LDH共有的保守位点，其中第102R(精氨酸)、162D(天冬氨酸)和189H(组氨酸)在空间位置上相互靠近，形成酶的活性中心。InterProSean在线分析表明该氨基酸序列有4个L-乳酸脱氢酶／苹果酸脱氢酶保守的催化位点，拓扑学结构分析该蛋白含有三个跨膜区V25GSVGMASAFALMEITG42、S124PNCIIVVVSNPVDVIXY141和Y243TSWAIGLTCRSLCNAIL260，N端位于膜内(i)，C端位于膜外(o)。在空间位置上，此三个跨膜区形成一个通道结构。亲水性分析表明，CsLDH具有三个高亲水性表位，分别为12aa-20aa、94aa-102aa以及10aa-18aa，94aa-102aa位于膜外部分，可能是主要的抗原表位。
2、华支睾吸虫乳酸脱氢酶(CsLDH)结构研究
设计引物从cDNA文库中扩增出CsLDH目的基因，琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA条带在1000bp左右，定向克隆获得的真核表达质粒pEGFP-N1-CsLDH，PCR、双酶切和测序鉴定证实重组质粒构建成功。pEGFP-N1-CsLDH转染HeLa细胞后培养24h在倒置荧光显微镜下观察可见绿色荧光分布于细胞核以外部位，而72h后在部分细胞的细胞膜上可见弱的绿色荧光；而转染pEGFP-N1质粒的HeLa细胞在24h和72h观察绿色荧光均匀分布于细胞内。转染了pEGFP-N1-CsLDH质粒的HeLa细胞检测到了CsLDH在mRNA水平的表达。细胞免疫组化表明CsLDH定位于HeLa细胞膜上。虫体免疫组化表明CsLDH主要分布在虫体表膜，口、腹吸盘、咽及肠支。将来源于CsLDH的两个表位基因片段定向克隆至pGEX-4T-1载体，获得重组的原核表达质粒pGEX-4T-1-E10-20及pGEX-4T-1-E94-102，经测序鉴定证实重组质粒构建成功。在1mmol／L IPTG、37℃下诱导表达重组融合蛋白，15％SDS-PAGE分析表达产物在26kDa处，超声裂解上清中有相应表达条带，证实可溶性表达获得成功。表达产物经亲和层析纯化，获得目的蛋白。经Western blotting和ELISA法分析，融合表达的E10-20及E94-102可以被CsLDH免疫血清识别，且对E94-102更易于识别；重组CsLDH也能被E10-20及E94-102免疫血清识别，而不能被对照血清识别。
3、抗吸虫药物对于重组CsLDH作用研究
吡喹酮：吡喹酮对重组的CsLDH催化丙酮酸还原成乳酸(正反应)以及乳酸氧化成丙酮酸(逆反应)都存在明显的抑制作用。药物浓度在8.0mmol／L时酶催化逆反应的活性被抑制了56.81％(P<0.01)；在9.0mmol／L浓度时酶催化正、逆反应的活性分别被抑制了94.03％(P<0.01)和94.07％(P<0.01)。
左旋咪唑：左旋咪唑在10mmol／L-120mmol／L范围内，对正反应无明显抑制作用，而对乳酸氧化成丙酮酸的逆反应则显示出明显的抑制作用，药物浓度在120mmol／L时，酶活性被抑制91.92％(p<0.01)，增大药物浓度时依然保持强的抑制作用。阿苯达唑：不同浓度的阿苯达唑对重组CsLDH催化的正、逆反应都显示出明显的抑制作用。同等药物浓度下，对正、逆反应抑制的程度差异不大，在0.20mmol／L时，对酶催化的正、逆反应的抑制分别为83.56％(p<0.01)和79.23％(p<0.01)。
芬苯达唑：芬苯达唑对正、逆反应均有抑制作用，但同等药物浓度下，对正反应的抑制作用要强于逆反应。在0.06mmol/L时，对酶催化的正反应的抑制作用为47.85％(p<0.01)，而对逆反应的抑制为30.39％(p<0.01)。在浓度为0.12mmol／L时，对酶催化的正反应抑制为92.2％(<0.01)，而逆反应抑制为86.13％(p<0.01)。
研究结论
1、CsLDH可能是皮层相关的膜蛋白，定位于皮层表膜；CsLDH催化中心的一个关键残基位于预测的膜外线性表位的末端，该表位特异性抗体可能会对酶活性产生影响。多种抗吸虫药物主要损伤皮层，CsLDH有可能是其作用靶点。
2、免疫组织化学显示CsLDH定位于虫体的咽部、肠支、表膜、口腹吸盘等能量代谢旺盛的内外环境界面；GFP蛋白示踪及免疫细胞化学证实CsLDH定位于细胞膜上，证实了CsLDH是膜蛋白的预测。重组的CsLDH免疫血清能特异识别GST融合表达的E10-20及E94-102表位，并且GST融合表位的特异性抗体也能识别CsLDH，而且E94-102表位抗血清能特异性抑制其活性，证实了生物信息学表位预测的正确性。
3、抗吸虫类的毗喹酮及苯并咪唑类药物对CsLDH酶促反应显示了明显的抑制作用，提示CsLDH是这些药物的作用靶点之一，进一步阐明了这些药物的分子作用机制。