研究目的和意义：　　 肝纤维化是一种严重危害人类身心健康的疾病，至今没有公认有效的治疗方法。因此，探索切实可行的治疗方案，其意义非常重大。既往的治疗多集中在抑制肝脏炎症反应和免疫反应上，现今已逐渐转向采取以肝星状细胞(hepaticstellate cells，HSC)为靶标的治疗策略。大量研究证实，HSC的异常激活并最终导致细胞外基质在肝内过量积聚，是肝纤维化发生的中心环节。抑制HSC增殖或促进其凋亡、抑制其分泌细胞外基质或促进细胞外基质降解，是治愈肝纤维化的关键。　　 针对如何诱导HSC凋亡和抑制其活化，几年来，国内外进行了许多尝试：如应用干扰素或肝细胞生长因子抑制HSC活化；应用霉菌代谢产物Gliotoxin诱导HSC凋亡；应用血管紧张素转化酶抑制剂抑制HSC分泌胶原等……但研究结果证明，多数药物或细胞因子的疗效都不明显；有的虽有疗效，但由于副作用太大而无法应用于临床。　　 近年来，有关骨髓间质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)的研究给治愈这一顽疾带来了希望。Terai和Sakaida从肝硬化小鼠尾静脉注入MSC，证实能改善肝功能并使肝纤维化减轻。Terai采用MSC对9名肝硬化患者实施试验性治疗，发现肝功能均明显好转。本课题组同期进行的类似研究(包括实验研究和临床试验)也证实了上述结论。这些均提示MSC移植可望成为治疗肝纤维化的有效方法。但问题是，MSC是如何发挥抗肝纤维化作用的呢?　　 早期的研究曾认为MSC治疗肝纤维化的机理主要是通过分化为肝细胞并修复肝损伤，但更多的研究结果并不支持这一观点，多数实验并未能找到MSC分化为肝细胞的证据。而前期实验中我们发现，植入的MSC最初是非选择性地分布在机体各组织中，随后选择性地在肝组织中聚集并长期存活。而且，MSC的分布部位多集中在纤维组织附近，而并非肝实质细胞位置；同时，我们利用小鼠源性MSC与HSC，建立共培养体系，发现MSC/HSC共培养或者在HSC培养基中加入MSC条件培养液均可抑制HSC的增殖，且抑制程度随培养时间的延长而增强，大量HSC由S期进入G0-G1期，其中S期细胞由18.58％减少为5.05％，而G0-G1期细胞则由62.72％提高到82.83％。这提示我们，MSC可能通过“旁分泌机制”调控HSC(如抑制HSC的增殖，诱导HSC凋亡，或调节HSC从激活态转变为静止态等)，从而发挥抗肝纤维化的作用。　　 MSC能分泌多种细胞因子(包括神经生长因子、肝细胞生长因子、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、白介素-6、白介素-10和单核细胞趋化吸引蛋白等)，找出调控HSC的细胞因子，是研究的关键所在。Li Y的研究证实MSC能够分泌神经生长因子(Nerve Growth Factor,NGF)，Trim N指出NGF能够在体外诱导HSC发生凋亡。　　 那么，MSC是否可诱导HSC凋亡和(或)抑制HSC活化呢?NGF是否在MSC通过“旁分泌机制”调控HSC的过程中起作用呢?在MSC调控HSC的过程中，还有哪些因子和(或)通路参与其中呢?　　 为了回答上述问题，本课题拟通过建立“人MSC与HSC体外共培养体系”，对该“旁分泌机制”做进一步研究：①通过流式细胞术、免疫印迹等技术研究MSC是否诱导HSC凋亡，抑制其活化；②通过Realtime PCR、免疫印迹及中和抗体等方法研究NGF在MSC调控HSC过程中的作用；③采用基因芯片技术筛选共培养体系中MSC上调的相关凋亡基因，分析其他可能在MSC诱导HSC凋亡过程中起作用的因子或细胞通路。从而揭示MSC对HSC的调控作用及机制，初步阐明MSC抗肝纤维化的机理。　　 第一部分 MSC对HSC调控作用的体外观察　　 材料与方法：　　 1、细胞来源　　 (1)激活型人HSC(中山大学实验动物中心)。　　 (2)人L-02肝细胞株(中山大学实验动物中心)。　　 (3)人MSC：采自中山大学附属第三医院临床无血液疾病志愿者髂骨内骨髓，共12例(男性9例、女性3例)。　　 2、MSC/HSC共培养体系的建立　　 利用孔径为0.4μm的transwell insert半透膜，在6孔板中建立非接触共培养体系。其中transwell作为培养体系上层，接种第3代MSC，数量为2×104 cells；培养体系下层为6孔塑料培养板，接种第5代的HSC，数量亦为2×104 cells。置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱常规培养，培养液为5％小牛血清L-DMEM。人L-02肝细胞为对照组。　　 3、免疫细胞化学检测　　 由于HSC表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)是其活化的特征性标志，本实验通过测定α-SMA确定HSC是否为活化状态。　　 4、流式细胞术检测细胞凋亡　　 不同组别HSC通过收集、处理后，用PI+Annexin V-FITC双染法进行流式细胞术，检测其凋亡情况。　　 5、免疫印迹法检测α-肌动蛋白　　 不同组别HSC通过收集、处理后，免疫印迹法检测各组α-SMA表达情况，并进行对比分析。　　 6、统计学分析　　 所有计量资料以均数±标准差((-X)±S)表示，应用SPSS10.0 for Windows软件处理，采用t检测与方差分析，P＜0.05为有统计学意义。　　 结论：　　 在体外共培养体系中，MSC可以透导活化态HSC凋亡。　　 第二部分 MSC旁分泌NGF诱导HSC凋亡的研究　　 材料与方法：　　 1、共培养体系的建立及中和抗体的添加　　 (1)实验组：MSC/HSC共培养，孔径0.4μm的Transwell作为培养体系上层，直径6cm的塑料培养皿作为培养体系下层，HSC和MSC以2×104的量分别接种于培养皿及Transwell中。　　 (2)对照组：HSC以2×104的量接种于培养皿中。分别在共培养及单独培养HSC培养基中添加Anti-human NGF antibody及recombinant human NGF-β。　　 2、HSC增殖检测　　 共培养7天后，利用Brdu免疫组织化学染色分析检测各组中HSC增殖情况的改变。　　 3、HSC凋亡检测　　 凋亡蛋白检测(Caspase-3/7)：运用Apo-ONE(R) Homogeneous Caspase-3/7 Assay试剂盒，分别检测对照组与实验组HSC的凋亡蛋白Caspase-3/7。　　 4、NGF/P75的RT-PCR分析　　 使用RT-PCR分析MSC、HSC及Hepatocyte中NGF及其低亲和力受体NGF的表达情况。　　 5、Real time-PCR定量分析MSC中NGF的表达　　 使用Real time-PCR(SYBR GreenⅠ)分析检测NGF在单独培养及共培养的MSC中的表达情况。　　 6、免疫印迹法检测P75　　 收集、处理不同组别的HSC，通过免疫印迹法检测各组P75蛋白表达情况，并进行对比分析。　　 7、统计学分析　　 所有计量资料以均数±标准差((-X)±S)表示，应用SPSS10.0 for Windows软件处理，采用t检测与方差分析，P＜0.05为有统计学意义。　　 结论：　　 MSC与HSC共培养过程中，MSC可分泌NGF,并与HSC表面表达的NGF低亲和力受体P75结合，从而诱导HSC凋亡。　　 第三部分基因芯片分析共培养后MSC凋亡相关基因的改变　　 材料与方法：　　 1、共培养体系的建立　　 (1)实验组：MSC/HSC共培养，孔径0.4μm的Transwell作为培养体系上层，直径6cm的塑料培养皿作为培养体系下层，HSC和MSC以2×104的量分别接种于培养皿及Transwell中。　　 (2)对照组：MSC以2×104的量接种子培养皿中。　　 2、处理标本　　 共培养72小时后，Trizol溶解MSC，提取RNA。　　 3、NaseI消化RNA样品，去除其中可能含有的基因组DNA及RNA，并进行纯化和质量检测　　 4、合成cDNA及基因芯片分析　　 Apoptosis PCR Array384HT进行凋亡基因筛查，分析MSC在共培养前后凋亡相关基因的变化，最后数据用△△Ct方法分析。　　 结论：　　 共培养后，MSC中显著上调的基因有：AKT1，PIK3R2，DAPK1，DHCR24，NOTCH2。