论文部分内容阅读
表观遗传学调控,指的是在DNA序列不改变的前提下调控基因的表达。RNA甲基化作为一种重要的调控方式,在哺乳动物早期胚胎的发育、小鼠精子发育和细胞分化等方面都发挥着重要的作用。TRDMT1(DNMT2)是一种RNA m5C甲基转移酶,主要催化以下三种tRNA甲基化,包括tRNAAsp、tRNAVal和tRNAGly。它能稳定基因组并有助于蛋白质合成。测序结果表明,斑马鱼基因组与人类基因组相似度高达87%,因此可以通过研究斑马鱼基因来研究相同人类基因的功能。本研究主要利用CRISPR/Cas9技术来敲除斑马鱼的Trdmt1基因从而研究其功能。利用CRISPR/Cas9技术,在斑马鱼Trdmt1基因的外显子上设计靶点,使靶点处基因组断裂,引入碱基随机插入和缺失,产生移码突变从而对基因进行编辑。从突变个体中筛选出Trdmt1基因纯合突变,研究Trdmt1基因敲除后对斑马鱼的生长发育和表型的影响,为今后继续深入研究Trdmt1基因功能提供理想的模型。研究结果如下:(1)构建斑马鱼Trddmt1基因敲除品系。利用网站chopchop在线设计靶点,挑选评分较高的多个gRNAs,将gRNA和Cas9的mRNA共同注射至小批量的斑马鱼胚胎中,进行酶切鉴定,选择酶切效率高的靶点进行后续大批量注射。然后选取拥有相同突变基因型的F0代斑马鱼进行交配,获得F1代。根据突变基因型设计鉴定引物,筛选获得阳性样本,将其进行PCR扩增后测序分析,筛选出Trdmt1纯合敲除个体。结果表明:设计的多个靶点中,gRNA1的酶切效率最高,大批量注射后,筛选出多种F0代斑马鱼基因突变型,分别为:缺少8 bp、插入22 bp和缺失39 bp。选择相同突变类型的雌雄斑马鱼进行交配,获得F1代。使用特异性鉴定引物进行鉴定,获得突变型样本,进一步进行PCR产物测序鉴定,结果表明成功获得Trdmt1基因纯合敲除的斑马鱼。(2)Trdmt1基因纯合敲除对斑马鱼生长发育和表型的影响。将获得的F1代Trdmt1基因敲除纯合突变型斑马鱼进行交配,获得F2代纯合突变型斑马鱼。对Trdmt1基因纯合敲除的斑马鱼胚胎的表型包括孵化率、存活率、畸形率等进行观测。结果表明,Trdmt1基因敲除不利于斑马鱼孵化,Trdmt1基因敲除斑马鱼的孵化率为50.06%,极显著低于野生型斑马鱼孵化率89.67%(p<0.01)。但对斑马鱼存活率和畸形率的影响不显著,其中Trdmt1基因敲除斑马鱼存活率和畸形率分别为84.17%和4.21%,野生型斑马鱼存活率和畸形率分别为89.64%和3.48%(P>0.05)。统计F2代斑马鱼雌雄比例发现,Trdmt1基因敲除的斑马鱼的雌雄比例为1:1.872,而野生型斑马鱼雌雄比例为1:0.836(p<0.01),这暗示Trdmt1基因敲除显著影响斑马鱼性别分化。本研究利用CRISPR/Cas9技术对斑马鱼Trdmt1基因进行敲除,筛选获得斑马鱼Trdmt1基因敲除的纯合子。对斑马鱼Trdmt1基因纯合敲除个体进行分析,发现Trdmt1基因敲除不利于斑马鱼孵化,对斑马鱼存活率和畸形率的影响不显著。此外,这对斑马鱼的性别分化也有一定影响,为畜牧学上水产类生物的性别选择提供了参考,也为今后进一步研究提供了有用的模型。