第一部分ILK在颈动脉球囊损伤大鼠模型中的表达变化目的：经皮冠状动脉介入治疗(Percutaneous Coronary Intervention,PCI)是目前治疗冠心病最为有效的方法,然而PCI术后血管再狭窄(Restenosis,RS)的发生制约了PCI的临床疗效,并严重影响了冠心病患者的临床预后。血管平滑肌细胞(Vasclar Smooth Muscle Cell,VSMC)的过度增殖和迁移是导致RS最为主要的原因,而VSMC由收缩表型向合成表型转换是血管损伤后VSMC过度增殖、迁移的始动环节。既往研究表明ILK是维持VSMC收缩表型所必须的基因之一。本部分研究旨在明确大鼠颈动脉血管损伤后再狭窄过程中ILK的表达变化。方法：大鼠颈动脉球囊损伤模型是目前研究血管损伤后内膜新生的最佳模型,本部分采用直径1.5-2.0 mm PTCA球囊导管建立大鼠颈动脉球囊损伤RS模型。分别进行以下实验：(1)通过酶联免疫吸附法检测大鼠血清中ILK表达水平；(2)Real-time PCR检测颈动脉血管ILK及PCNA mRNA水平的情况；(3)Western blot检测VSMC表型标记物及ILK蛋白表达变化；(4)免疫荧光染色观察颈动脉ILK及SM a-actin的表达及定位。结果：大鼠球囊损伤术后新生内膜明显向管腔内增生,细胞外基质增加,内膜继续增厚,造成明显的管腔狭窄。具体结果如下：(1)损伤后7天血清ILK水平较术后即刻明显降低达30.8%(P<0.05),损伤后14天ILK水平较7天时进一步降低(P>0.05)。(2)损伤后7天PCNA mRNA水平较损伤后明显增加,损伤后14天PCNA mRNA进一步增加(P均<0.05)；而ILK mRNA水平在7、14天后显著降低分别达36%、48%(P均<0.05)；(3)损伤后7天、14天Osteoptin蛋白水平较损伤后即刻增加34%、42%(P均<0.05);术后7天、14天Calponin蛋白水平显著降低分别达22%、56%(P均<0.05);术后7天、14天SM a-actin蛋白水平分别降低26%、32%(P均<0.05)。(4)损伤后7天、14天PCNA蛋白水平较损伤后即刻增加130%、270%(P均<0.05)；损伤后14天PCNA蛋白进一步增加(P<0.05),而术后7天、14天ILK蛋白水平显著降低分别达50%、88%(P均<0.05),损伤后14天ILK蛋白水平较7天时进一步降低(P<0.05)。(5)正常颈动脉内ILK在血管平滑肌细胞胞浆中表达丰富,损伤14天后,颈动脉平滑肌细胞内ILK表达明显减少。结论：ILK在成年大鼠颈动脉血管平滑肌细胞层胞浆内大量表达,大鼠颈动脉球囊损伤术后SMC增殖明显,SMC合成基因增加而收缩表型标记物蛋白表达下调,同时血清ILK浓度以及血管内ILK mRNA和蛋白水平均一致性呈现明显的降低趋势。第二部分ILK参与VSMC表型转换的分子机制研究目的：VSMC由收缩表型向合成表型转换是血管损伤后VSMC过度增殖、迁移的始动环节。血小板衍生生长因子BB(Platelet Derived Growth Factor BB, PDGF-BB)是VSMC表型调节的主要因子之一。位于SMC标志基因启动子的CArG盒子[CC(A/T)6GG] DNA序列在调节SMC标志基因的转录中起着关键的作用,血清效应因子(Serum Response Factor,SRF)只有与CArG盒子DNA结合,才能够激活参与SMC分化和增殖基因的转录表达。Myocardin可与SRF结合,激活SRF-CArG相互作用,促进SMC收缩基因的表达和分化；而转录激活因子ETS样蛋白1(ETS-like 1,Elk-1)作为另一个主要的SRF辅激活因子,在胞质信号调控下磷酸化,竞争性取代Myocardin与SRF的相合,形成Elk-1/SRF复合物,引起SMC收缩基因启动子与Elk-1的结合增加而Myocardin结合降低,收缩基因表达下调,并导致SMC向合成表型转换。我们前期在体研究己证实ILK在成年大鼠颈动脉血管平滑肌细胞层胞浆内大量表达,而大鼠颈动脉球囊损伤RS模型中ILK浓度以及血管内ILKmRNA口蛋白水平均一致性显著降低。研究表明ILK是维持SMC收缩表型所必须的基因之一,但有关ILK影响VSMC表型转换的分子机制研究尚不清楚。我们推测ILK可能通过影响Myocardin参与VSMC的表型转换调节,影响RS的发生与发展。方法：具体的方法包括：原代大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养；腺病毒表达载体及质粒载体的构建及细胞转染；ILK小干扰RNA(SiRNA)质粒的构建和细胞转染；F-actin细胞骨架染色；ILK激酶活性测定；免疫共沉淀分析(Coimmunoprecipitation,Co-IP);双荧光素酶报告基因分析；染色质免疫共沉淀分析(Chromatin immunoprecipitation assay,ChIP);实时荧光定量PCR及Western blot分析等。结果：1.ILK在PDGF-BB短期干预诱导VSMC表型转换过程的作用及机制PDGF-BB(25ng/mL)预孵育VSMC细胞1h,发现：(1)PDGF-BB可以显著抑制ILK激酶活性。(2)Western blot分析结果显示,PDGF-BB干预VSMC 1h明显促进Elk-1磷酸化,而对ILK及Myocardin蛋白表达水平无影响。(3)免疫共沉淀发现PDGF-BB短期干预导致Elk-1竞争性取代Myocardin与SRF的相合,导致Myocardin与SRF结合减少,而Elk-I与SRF结合增多。(4)采用ChIP实验发现Myocardin与SM a-actin基因启动子结合减少,而Elk-1与SM a-actin启动子结合增多。2.ILK在PDGF-BB长期干预诱导VSMC表型转换过程的作用及机制以VSMC表型标志基因如SM a-actin、SM 22a、Calponin及Osteoptin表达水平作为判定VSMC表型的指标,并通过F-actin染色评估不同表型VSMC形态差异。一方面,通过ILK-SiRNA技术阻断内源性ILK的表达后,观察VSMC标志基因及形态的影响;另一方面,通过Ad-ILK腺病毒转染VSMC过表达ILK后。观察ILK对PDGF-BB诱导VSMC表型变化的影响,结果如下。2.1.PDGF-BB对SMC标志基因及ILK、Myocardin蛋白等影响PDGF-BB(25ng/ml)孵育VSMC 48h后,SM a-actin、SM 22a和Calponin蛋白表达均被显著抑制(与对照组相比较,P均<0.05),而去分化基因Osteoptin蛋白表达则明显升高,但与对照组比较无统计差异(P>0.05)；同时发现PDGF-BB亦引起ILK及Myocardin蛋白表达下调(与对照组相比较,P均<0.05),而对Elk-1及SRF等蛋白表达无影响(与对照组相比较,P均>0.05)。2.2.ILK是维持VSMC分化表型所必须基因之一VSMC转染SiRNA-ILK可使ILK蛋白表达水平降低达68%(P<0.05),同时显著降低了Myocardin蛋白的表达(P<0.05)。通过实时荧光定量PCR及Western blot检测均表明,转染SiRNA-ILK的VSMC中,分化标志基因SMa-actin、SM 22a及Calponin的mRNA及蛋白水平呈一致性下降,且明显降低了TGF-β诱导的上述分化标志基因表达的上调。VSMC在通过SiRNA转染抑制ILK表达后,细胞体积增大,而F-actin呈短小的束状,无规则散在分布于细胞内,交错无序排列。以上结果表明ILK是VSMC分化标志基因表达所必须的基因之一,且参与了VSMC细胞内应力纤维束的组装及重排。2.3.ILK过表达阻遏PDGF-BB诱导的VSMC去分化转换通过构建Ad-ILK过表达病毒载体并转染VMSC 24h后,免疫荧光检测显示,Ad-ILK组ILK荧光强度较Ad-GFP对照组明显增强；Western blot检测发现,与Ad-GFP感染组比较,Ad-ILK感染组ILK蛋白表达水平上调70%,同时Ad-ILK感染组Myocardin蛋白水平增加近31%;说明Ad-ILK转染VSMC显著促进ILK过表达后可明显增强Myocardin蛋白表达。通过实时荧光定量PCR及Western blot检测均表明,转染Ad-ILK的VSMC中,分化标志基因SMa-actin、SM 22a及Calponin的mRNA及蛋白水平呈一致性上调,而VSMC去分化标志物Osteopontin蛋白表达与分化标志基因的表达情况正好相反。VSMC转染Ad-ILK后,胞质内F-actin由随机散乱的束状纵向平行排列,形成整齐的应力纤维,使VSMC细胞形态向纺锤形转化,维持VSMC的分化状态。以上结果表明ILK过表达可明显逆转去分化因子PDGF-BB引起的SMC分化标志基因mRNA及蛋白水平的下调,部分阻遏PDGF-BB诱导的VSMC去分化。2.4.ILK逆转PDGF-BB诱导的VSMC去分化信号机制本部分采用荧光素酶报告基因分析及ChIP检测评价ILK在PDGF-BB诱导VSMC去分化信号中的具体机制。具体结果如下：(1)通过SMC标志基因启动子荧光素酶报告基因分析表明,与Ad-GFP组比较,PDGF-BB干预可显著降低SM a-actin及Calponin的启动子活性(P均<0.05)。过表达ILK则可明显逆转PDGF-BB引起的SMC标志基因启动子活性下降,与Ad-GFP+PDGF-BB组比较,Ad-ILK+PDGF-BB组SM a-actin启动子活性显著升高达26.6%(P<0.05),Calponin启动子活性亦上调达10%(P>0.05)。(2)通过ChIP-PCR检测我们发现,PDGF-BB可显著减少SMC标志基因SMa-actin及Calponin基因启动子区域同SRF的结合(P<0.05),过表达ILK则可明显逆转PDGF-BB引起的SMC标志基因启动子同SRF结合下降,与Ad-GFP+PDGF-BB组比较,Ad-ILK+PDGF-BB组SM a-actin启动子同SRF结合的数量显著升高达30.1%(P<0.05),Calponin启动子同SRF结合的数量亦上调达29.0%(P<0.05)。结论：1. PDGF-BB短期干预引起ILK激酶活性下降,导致Elk-I磷酸化增强,竞争性取代Myocardin与SRF的相合,继而导致Myocardin与SMC标志基因SM 22a启动子的结合减少,使SMC收缩标志基因表达下调。2. PDGF-BB长期干预引起ILK及Myocardin蛋白表达下调,ILK是维持VSMC分化表型所必须基因之一,ILK过表达阻遏PDGF-BB诱导的VSMC去分化转换,逆转PDGF-BB引起的SMC标志基因启动子活性下降,并进一步逆转PDGF-BB引起的SMC标志基因启动子同SRF结合下降。第三部分地高辛通过上调ILK信号抑制PDGF-BB诱导的VSMC增殖、迁移和抑制血管损伤后新生内膜形成目的：地高辛作为一种经典的强心苷类药物,在治疗充血性心力衰竭方面占有重要地位。新近的研究表明,地高辛尚参与多种病理和生理过程,并可通过抗增殖、促凋亡等作用对多种肿瘤细胞发挥抑瘤作用。我们既往的研究首次证实地高辛通过降低CDK4(Cyclin-Dependent Kinases 4)、CDK6蛋白的表达水平,上调p27kip1蛋白的表达,阻止细胞进入分裂期来抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖。本部分进一步评价地高辛是否通过上调ILK信号抑制PDGF-BB诱导的VSMC增殖、迁移和抑制血管损伤后新生内膜形成。方法：(1)体外实验部分：通过MTT(Methyl Thiazolyl Tetrazolium)法评价VSMC增殖水平的变化,细胞迁移研究采用Transwell进行,实时荧光定量PCR及Western blot评价地高辛对PDGF-BB诱导SMC表型标志基因SM-α-actin、calponin和SM 22a mRNA及蛋白水平变化的影响,(2)体内实验部分：通过颈动脉球囊损伤建立大鼠RS模型,评价地高辛是否可在体抑制VSMC增殖并抑制新生内膜形成。结果：本部分研究表明,地高辛通过下调CDK活性和恢复p27kip1水平抑制PDGF-BB诱导的VSMC增殖；地高辛恢复PDGF-BB诱导的ILK表达下降并阻止PDGF-BB诱导的GSK 3β活性上调；进一步发现地高辛显著抑制基质金属蛋白酶家族(Matrix metallopeptidase,MMPs)表达；最后,地高辛明显抑制体内VSMC的增殖并抑制RS中新生内膜的形成。结论：地高辛抑制PDGF-BB诱导的VSMC增殖、迁移及表型转换,并抑制RS后新生内膜形成,其机制部分是通过上调ILK信号通路完成。