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背景心肌梗死后心肌纤维化严重影响氧传输、电信号传导、心脏舒张及收缩功能等,所以有效防治心肌梗死后心肌纤维化的发生发展显得至关重要。然而,即使经过数十年的不懈研究,截至目前为止仍未找到针对心肌纤维化的有效治疗方法。Anoctamin 1(ANO1)于2008年首次被证实为经典钙激活氯离子通道(CaCC)的分子基础,自此引领了世界范围内对ANO1研究的热潮。之后的众多研究表明,ANO1参与了众多细胞的增殖、迁移和分化等生理病理进程,这从而奠定了我们假设ANO1参与了心肌梗死后心肌纤维化的基础。目的研究ANO1对心肌梗死后心肌纤维化是否有抑制作用,并探讨其作用机制。方法和内容b)乳大鼠心肌成纤维细胞的分离和培养从新生1-3天Sprague-Dawley(SD)乳大鼠心脏提取和分离心肌细胞与心肌成纤维细胞,并于DMEM高糖培养基中培养,心肌细胞以及第2-3代心肌成纤维细胞留供后续实验使用。c)构建编码ANO1的重组腺病毒载体及感染乳大鼠心肌成纤维细胞ANO1重组腺病毒载体由上海吉凯基因化学技术有限公司构建的;本课题组检测了 ANO1重组腺病毒载体感染ANO1的效率。d)心肌成纤维细胞的缺氧实验将培养的第2-3代心肌成纤维细胞进行缺氧处理;继而通过MTT检测细胞增殖,qRT-PCR检测ANO1基因表达,蛋白免疫印迹检测缺氧后相关蛋白的表达。e)心肌梗死动物模型的构建以及病毒载体的转染采用8-10周龄C57B1/6J雄性小鼠进行冠状动脉前降支结扎从而构建心肌梗死模型;并于小鼠心肌中注入重组病毒载体从而完成ANO1重组腺病毒载体于小鼠体内的转染。f)过表达ANO1对心肌成纤维细胞缺氧后纤维化指标的影响心肌成纤维细胞过表达ANO1后进行缺氧处理,继之通过MTT检测细胞增殖,qRT-PCR检测ANO1基因表达,蛋白免疫印迹检测纤维化相关蛋白的表达。g)过表达ANO1对小鼠心肌梗死后纤维化指标的影响构建ANO1小鼠模型后,结扎小鼠冠状动脉前降支构建心梗模型;继之通过免疫组化、蛋白免疫印迹检测相关纤维化指标。h)明确TGF-β/smad3通路在ANO1抑制心肌梗死后心肌纤维化中的作用;通过蛋白免疫印迹实验检测缺氧后及过表达ANO1后TGF-β、p-smad3及相关纤维化指标的蛋白表达。i)统计学处理所有数据通过SPSS 17.0系统进行分析,并使用GraphPad Prism软件进行数据的图像呈现。所有的实验都重复至少三次。数据进行了方差分析和t检验,P<0.05有统计学意义。结果1.ANO1表达于心肌成纤维细胞通过qRT-PCR、蛋白免疫印迹和细胞免疫荧光检测心肌细胞与心肌成纤维细胞中ANO1表达,得出ANO1较高水平的表达于心肌成纤维细胞中。2.心肌成纤维细胞缺氧后纤维化指标与ANO1表达均升高1)MTT结果显示:心肌成纤维细胞在缺氧0,6,8,10,16和24小时呈逐渐增殖趋势;2)蛋白免疫印迹结果显示:a-SMA的表达于心肌成纤维细胞缺氧0,6,8,10,16和24小时呈逐渐增加趋势;ANO1蛋白表达也随缺氧时间的增加而呈增加趋势,并于缺氧16小时时达到表达高峰;3)qRT-PCR结果显示:ANO1 mRNA表达随心肌成纤维细胞缺氧时间的增加而增加,并于缺氧16小时达到表达高峰。3.心肌梗死后ANO1表达增加蛋白免疫印迹结果显示与假手术组相比心肌梗死后ANO1的表达增加。4.过表达ANO1降低了缺氧后心肌纤维化指标1)首先qRT-PCR和蛋白免疫印迹结果证实心肌成纤维细胞过表达ANO1;2)MTT结果显示:过表达ANO1心肌成纤维细胞于缺氧后细胞的增殖明显降低;3)蛋白免疫印迹结果显示:过表达ANO1心肌成纤维细胞于缺氧后其a-SMA和collagen I蛋白表达明显降低;5.ANO1降低了心肌梗死后心肌纤维化程度1)Masson染色结果表明:过表达ANO1心肌组织于心肌梗死后其纤维化程度明显降低;2)蛋白免疫印迹和免疫荧光结果显示:过表达ANO1心肌组织于心肌梗死后其a-SMA蛋白表达明显降低;6.过表达ANO1抑制了缺氧对TGF-β/smad3通路的激活作用1)蛋白免疫印迹结果显示:心肌成纤维细胞于缺氧0,6,8,10,16和24小时TGF-β、p-smad3蛋白表达逐渐增加,且其增加趋势与ANO1表达相一致;2)心肌成纤维细胞过表达ANO1,其细胞TGF-β、p-smad3表达于缺氧后明显降低(与阴性对照空载腺病毒转染组相比)。结论ANO1通过抑制TGF-β/smad3信号通路活性从而抑制心肌梗死后心肌纤维化。