目的:1.检测辛伐他汀在体内外对K562细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响。2.探讨辛伐他汀在体内外诱导K562细胞凋亡的分子机制。方法:1.采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法和流式细胞术(FCM),检测辛伐他汀在体外对K562细胞细胞增殖,细胞周期和细胞凋亡的影响。2.采用RT-PCR技术检测辛伐他汀对K562细胞Ras-MAPK通路,PI3K-AKT通路NF-κB通路的基因作比较全面分析检测,以期找到明显差异表达的基因,同时对找出的显差异表达的基因采用免疫组化和western blot的方法分析其蛋白水平的表达差异。3.体外培养K562细胞,构建慢性粒细胞白血病K562细胞的移植瘤模型,用流式细胞仪检测不同浓度辛伐他汀在裸鼠体内作用K562细胞后细胞周期的变化,用缺口末端标记技术TUNEL法检测辛伐他汀K562细胞早期凋亡的变化。4.用RT-PCR技术分析辛伐他汀对K562细胞的,Ras-MAPK通路,PI3K-AKT通路NF-κB通路的基因作全面分析检测,以期找到明显差异表达的基因,同时对找出的显差异表达的基因采用免疫组化和western blot的方法分析其蛋白水平的表达差异。结果1、MTT实验显示, 20umol/L辛伐他汀随着对K562细胞作用时间的延长,细胞增殖抑制率明显升高(p<0.01)。2、辛伐他汀作用K562细胞24h即引起细胞凋亡率发生明显变化(11.33±0.86%),随时间延长细胞凋亡率逐渐增高(p<0.01)。3、与对照组相比,辛伐他汀分别作用24h、48h、72h能够使K562细胞发生G0/G1期阻滞, 48hG0/G1期百分比升高明显(52.5%),处理组48h的G2/M期百分比(1.4%)和PI(0.4750)降低最为明显。4、随着辛伐他汀作用K562细胞时间的延长,N-Ras mRNA出现表达下调,以72h后出现下调最明显.辛伐他汀作用K562细胞各时间段之间N-Ras mRNA的差异表达表达明显(p<0.01)。处理组的c-Raf-1mRNA表达随着药物作用时间的延长出现下调趋势,并以72h降低最为明显。药物处理各时间段的c-Raf-1mRNA差异表达有统计学意义(p<0.01)。处理组的ERK1 mRNA表达随着药物作用时间的延长均出现降低趋势,以辛伐他汀处理72h降低最为明显。药物处理K562细胞24h、48h、72h各时间段之间差异表达显著(p<0.01)。同时免疫组化结果提示处理组ERK1随药物作用时间的延长,蛋白表达水平出现下调(p<0.01);同一时间内对照组ERK1的蛋白表达水平均高于药物处理组(p<0.01)。5、与对照组相比,在辛伐他汀作用K562细胞24h即诱导PI3KmRNA的表达下调,并随药物时间的延长出现一直保持下调趋势,处理组药物作用的各时间段之间差异表达具有统计学意义(p<0.01)。处理组AKT1 mRNA随药物作用时间的增加出现下调趋势,处理组各时间段之间AKT1 mRNA差异表达明显(p<0.01)。处理组BCL-XL mRNA随药物作用时间的延长表现出一定的上调趋势,特别是48h和72h之间存在明显的差异表达(p<0.05)。对照组和处理组BCL-XL mRNA明显差异表达(p<0.01)。6、辛伐他汀处理K562细胞24h即诱导IKK-βmRNA的表达下调,并随药物时间的延长出现一直保持下调趋势。处理组IKK-βmRNA在24h与48h之间及24h与72h之间的差异表达具有统计学意义(p<0.01)。处理组NFκB1 mRNA随辛伐他汀作用时间的延长表现出明显下调趋势,处理组的NFκB1 mRNA各时间段之间差异表达具有统计学意义(p<0.01)。辛伐他汀能明显抑制K562细胞中IκB-αmRNA的表达,在药物处理48h时即出现明显下调(p<0.01),同时药物作用到72h时仍然保持明显下调(p<0.01)。7、与对照组相比,T1组裸鼠K562细胞G0/G1百分比明显升高(41.27±4.59%,p<0.05), K562细胞发生G0/G1停滞, T1组G2/M期百分比显著降低。8、用TUNEL法检测对照、T1、T2组肿瘤组织K562细胞中凋亡细胞,并用Image pro-plus5.1对凋亡细胞进行分析,计算累计光密度值(IOD),三组K562细胞中凋亡细胞的数量经比较具有统计学差异(P<0.01)。9、N-Ras mRNA随辛伐他汀剂量的加大明显表达下调,对照组和处理组之间的N-Ras mRNA差异表达有统计学意义(P<0.01)。c-Raf-1 mRNA也随药物剂量的增加出现表达下调,对照组与处理组之间的c-Raf-1 mRNA差异表达有统计学意义(P<0.01)。ERK1mRNA也随辛伐他汀剂量的加大明显表达下调,对照组与处理组组间ERK1mRNA的差异表达有统计学意义(P<0.01)。免疫组化和western blot结果提示,p-ERK随辛伐他汀剂量的增加,蛋白表达水平出现下调,对照组和处理组组间p-ERK蛋白差异表达有统计学意义(P<0.01)。10、PI3KmRNA在对照组与处理组之间表达差异有统计学意义,PI3KmRNA在对照组与T1、T2组的差异表达分别都具有统计学意义(P<0.01)。AKT1mRNA在对照组与处理组之间也有统计学意义(P<0.01)。辛伐他汀能够引起NFκB1和IKK-β的表达下调,对照组与处理组之间的NFκB1 mRNA的差异表达有统计学意义(P<0.01)。T1组和对照组之间及T2组和对照组之间IKK-βmRNA差异表达分别都有统计学意义(P<0.01),且处理组之间IKK-βmRNA的差异表达有统计学意义(P<0.01)。对照组与处理组之间的IκB-αmRNA的差异表达有统计学意义(P<0.01)。对照组与处理组之间的caspase-9mRNA差异表达有统计学意义(P<0.01)。结论1.辛伐他汀在体内外均能诱导K562细胞发生明显的凋亡,在体外能够诱导明显的K562细胞增殖抑制和G0/G1期阻滞,低剂量组的辛伐他汀在裸鼠体内能够诱导明显的K562细胞G0/G1期阻滞。2.辛伐他汀对K562细胞作用的体外实验研究表明,与对照组相比,辛伐他汀能够诱导Ras-MAPK信号通路的N-ras,PI3K-AKT通路的PI3K、BCL-XL和NF-κB信号转导通路的IKK-β的明显表达下调,可能是辛伐他汀体外诱导K562细胞增殖抑制和凋亡的明显靶点。3.辛伐他汀的裸鼠体内实验研究表明,辛伐他汀能够诱导Ras-MAPK信号通路的N-ras, c-Raf-1和Erk1和/或基因和蛋白水平的明显下调,说明Ras-MAPK通路可能是辛伐他汀诱导体内K562细胞增殖抑制和凋亡的重要信号通路.另外,辛伐他汀也能够诱导NFκB信号通路的IκB-α,NF-κB1、IKK-β的基因的明显下调,说明NFκB也可能是辛伐他汀诱导体内K562细胞凋亡的重要信号通路。4.辛伐他汀在体内不能引起PI3K-AKT信号通路的PI3K,AKT1的表达下调,但可能通过诱导其下游的caspase-9的表达上调参与辛伐他汀诱导体内K562细胞凋亡的发生。5.辛伐他汀在体内外诱导K562细胞的Ras-MAPK, PI3K-AKT, NFκB信号通路基因差异表达的趋势基本一致,但对PI3K-AKT信号通路的PI3K,AKT1存在显著差别.说明辛伐他汀在体内外诱导K562细胞凋亡可能存在不同的机制。