龟鳖类是爬行动物中较为古老的类群与恐龙同代,最早出现在晚三叠纪,至今已有2.5亿多年的历史,龟鳖类动物在漫长的地史演变和物种进化方面具有重要的参考价值。鼋(Pelochelys cantorii)是我国内陆体型最大的水生龟鳖动物之一。历史上广泛分布在东南亚各国,近现代由于不正当贸易及人类的滥捕导致鼋栖息地生境不断恶化,分布区逐渐缩小,种群数量锐减,鼋已经处于极度濒危状态,在一些地域甚至已经灭绝,于1989年被列入国家一级重点水生野生保护动物,2000年被世界自然保护联盟(IUCN)认定为濒危动物,2003年列入濒临绝种野生动植物国际贸易公约(CITES)附录Ⅱ名单。我国虽然成立了一些以鼋为保护对象自然保护区,但到目前为止这种与大熊猫和扬子鳄齐名的珍稀濒危物种根本没有得到应有的重视,相关的研究报道极少,近10年也基本上没有关于鼋野外个体的报道。鉴于此,本研究通过调查我国鼋自然保护区以及人工驯养基地,总结了我国鼋保护现状;通过人工驯养的6只亲鼋,研究了鼋的产卵时间、产卵行为、产卵特性、孵化和生长等繁殖生物学特性;基于二代基因组测序开展了物种进化等相关分析;进行了形态、DNA含量、细胞核型等种质特性研究;建立了鼋微卫星多重PCR体系的亲子鉴定技术;最后根据鼋生物学特性以及资源分布现状,对鼋种质资源的管理与保护提出合理性建议。本论文主要研究结果如下:1. 通过对鼋自然保护区资源状况半结构式访谈法,发现浙江省丽水市青田县鼋自然保护区(全国唯一一个鼋省级自然保护区)和广东省肇庆市广宁县自然保护区(县级自然保护区)的保护管理工作方面做得较好,指标分数为3.75和3.0(总分4分),但鼋栖息地环境情况依然不容乐观。尤其有3处保护区保护状况指数仅为1.25,保护区管理基本上形同虚设。其它一些县市的保护管理工作很薄弱,鼋赖以生存的栖息地环境基本上均破坏严重。全国目前有鼋人工驯养基地5处,其中有2处成功进行了鼋人工繁育。通过对我国成功开展鼋人工繁育保护区的河段沿岸村民进行问卷调查,结果表明63.6%的沿岸村民不认识鼋,仅有15.2%的渔民见过鼋,并且大部分发生在前10～20年。77.3%的渔民认为河段建立的水坝导致河段鱼的种类和数量变少,同时72.7%渔民认为沿岸建立的工厂排污导致该河段水质污染。总的来说,虽然历史上鼋分布广泛,但由于近年来的人类活动干扰,鼋在空间分布上越来越碎片化,目前数量稀少,处于濒危状态。可见,我国鼋的保护情况不容乐观。2.2014～2019年,分别对初次性成熟2只广宁的鼋(1雌1雄)以及产卵多年4只高明的鼋(2雌2雄)开展了繁育生物学研究。人工驯养鼋的产卵期集中在5～8月,夜间产卵,无护卵行为。通过视频观察分析,鼋产卵过程可分为Ⅳ个阶段。初次产卵的广宁鼋和已产卵多年的高明鼋在产卵特征方面具有显著差异:广宁鼋2014年产3窝卵,平均每窝22.0±3.0枚,卵平均重13.27±0.97 g,卵直径2.90±0.12cm,刚孵出稚鼋体重为10.00±0.56 g。高明雌鼋年产卵5～6窝,平均每窝43.6±8.2枚,卵平均重为17.31±1.99 g,卵直径为3.13±0.25 cm,刚孵出稚鼋重13.31±1.03 g。每窝卵的产卵用时(T,min)与每窝卵数量(N)具有正相关关系,N=4.3863 T-0.9059(r=0.872,P<0.01),平均13.67 s产1枚卵。平均产卵间隔天数为16.49±4.32d,中位数为15 d。鼋卵重(We,g)和卵直径(De,cm)间有显著相关性We=8.3362De-8.8494(r=0.861,P<0.01)。在温度28.8℃±1.5℃,介质湿度59.9±4.9%RH条件下,鼋卵孵化期为64.94±3.47 d。高明2只雌鼋每窝产卵量无明显差异,但体重大的雌鼋产的卵均重显著大于体重轻的雌鼋,卵大,孵出的稚鼋也大,且差异显著。孵出的稚鼋以活鱼苗为饵料,在温室内人工养殖周年,均重可以达510.30±82.77 g。建立的生长公式为Y=1.4993 t+58.521(R~2=0.991,t为此阶段培育天数d,Y为体重g)。高明鼋2019年孵化率为78.39%,苗种培育成活率达到93.33%,5年共成功繁育出鼋子代群体700余只。这些研究实现了鼋人工保种,丰富了繁育生物学基础数据,为其保护提供了物质和理论基础。3. 为了更好的认识和保护鼋,开展了鼋种质特性研究。鼋雌雄个体在尾巴长度、泄殖孔颜色方面有明显区别,另外,稚幼鼋和成鼋在体表斑纹方面也有明显不同。在形态可量性状方面,鼋和中华鳖在背甲长/背甲宽、吻长/背甲长、吻突长/背甲长、眼间距/背甲长、体高/背甲长等性状比值方面均有明显差异。164只新生到3龄鼋的体长(SCL)-体重(TW)关系为log TW=log 0.148+2.858×log SCL,同人工养殖的中华鳖类似,均属非逆速生长模式。鼋细胞DNA含量大小为3.1033±0.722 pg/2c,明显小于中华鳖的4.0967±0.1430 pg/2c。通过对1只鼋的肝细胞原代培养获得的细胞分裂中期图的染色体分析,结果显示鼋体细胞染色体数2n=62。这些种质特性研究,为鼋的物种鉴别提供了理论指导。4. 基于全基因组鸟枪法测序策略(WGS),利用Illuminate Hiseq 2500测序系统,对鼋进行了基因组测序、组装和分析。获得了293.4 Gb基因组初始数据,鼋组装的基因组Contig N50的长度为32.2 Kb,Scaffold N50的长度为1.47 Mb,组装获得了高质量的全基因组图谱,预测鼋基因组大小约2.27 Gb。鼋基因组平均GC含量为44.9%,稍高于中华鳖、绿海龟、西部锦龟等近缘物种。基因组注释得到的重复序列占总序列的40.34%,其中LINE重复序列最高,达到了28.73%,SINE仅为0.99%。通过多种方法结合注释出的鼋蛋白编码基因集有个19767个基因,平均转录本的长度为40629 bp,平均CDs的长度为1637 bp,基因的平均外显子个数为8.75个,外显子的平均长度为187 bp,内含子的平均长度为5029 bp。利用14个物种的100个单拷贝同源基因家族构建的进化树显示,鼋与中华鳖的分歧时间大约为55×10~6年之前。通过CAFE软件基于最近共同祖先分析结果表明:同其它12个物种相比,鼋扩张了684个基因家族,收缩了2485个基因家族。利用PSMC对种群历史动态分析表明:鼋、中华鳖在10~6～4×10~6年间发生了种群衰减,鼋在2.5×10~5～5×10~5年间出现有效种群数量翻倍的情况,而绿海龟有效种群大小一直保持相对较低的水平。5. 对鼋的全基因组数据进行扫描,共发现了182277个微卫星序列,将通过过滤筛选获得的62个位点作为候选标记,使用35只鼋个体基因组DNA对候选标记进行多态性检测。查看分型结果,筛选具备多态性的微卫星位点,构建了两组微卫星标记多重PCR体系,每个多重PCR体系包含12个标记。两组多重PCR全部位点基因分型成功率分别为97.1%和99.2%。通过GERUD2软件分析表明,使用1 0 个位点在已知双亲信息的情况下,可以鉴定99.8%的子代,已知一个亲本的情况下可鉴定97.8%的子代,在双亲未知的情况下,仍有87.9%的子代个体可被鉴定。在2组同窝后代样本中发现了多重父权现象,表明雌性亲鼋个体可能存在多次交配现象。6.通过鼋资源环境调查情况及生物学研究资料,分析认为鼋濒危主要有以下二大方面的原因。一是内在原因,鼋性成熟周期长,很多个体未能长到成年就死亡。具吞咽食物和潜沙的习性,易被人类捕获。二是客观原因,主要是人为捕杀、水利工程建设、过段开采河砂、水环境污染、入侵物种威胁等原因。针对保护工作情况以及存在的问题,为切实拯救和保护这一濒危物种,提出了以下建议:加强野外资源调查及栖息地环境监测、加强自然保护区建设和管理、积极开展鼋栖息地修复和有效保护、深入开展人工繁育技术研究、建立人工繁育群体、迁地保护及增殖放流、加强公众宣传和科普教育等建议。