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原发性肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是中国和部分亚洲地区最常见的恶性肿瘤之一，具有复发率高，预后较差的特点，严重威胁着人类的健康。尽管目前对原发性肝癌的治疗已取得一些进展，但对于晚期患者的治疗和预防复发及转移效果仍不理想，因此，有必要寻求一种更为有效的治疗手段。围绕着树突状细胞建立的特异性肿瘤免疫治疗方法，为免疫治疗原发性肝癌提供了新方法。甲胎蛋白( alpha-feto protein，AFP)主要见于肝癌和生殖细胞来源的肿瘤，是一种胚胎抗原，在70%-80%的原发性肝癌中有较高的表达水平，因此，是HCC免疫治疗的一个良好的靶分子。在以往的研究中证实AFP能够作为一种潜在的诱导特异性的CTL反应的肿瘤抗原用于AFP分泌性肝癌的靶向性免疫治疗。但是以AFP作为靶点均存在诱导免疫效应弱的缺点。而利用转基因技术将某些细胞因子基因导入DC（例如IL-18），具有增强原先较低的肿瘤细胞的免疫原性，提高宿主对肿瘤抗原识别能力以及增强DC的肿瘤抗原递呈的功能，从而达到诱导更强的抗肿瘤免疫效应的目的。因此，在本研究中，我们在以AFP基因为靶点的基础上，联合IL-18基因，通过腺病毒介导Ad-AFP和Ad-IL-18共感染DC，探讨其能否增强DC免疫刺激功能、提高AFP特异性CTL免疫效应的可行性。第一部分：人IL-18、AFP基因腺病毒表达载体的构建及鉴定目的构建能高效转导AFP、IL-18基因的重组腺病毒，进行病毒扩增和滴度测定，并检测AFP、IL-18抗原表达，以用于DC基因治疗的实验研究。方法应用AdEasy?腺病毒表达载体系统分别构建表达AFP、IL-18的重组腺病毒和对照载体Ad-GFP。目的基因首先克隆到pShuttle-CMV形成穿梭载体，然后转染到高效的原核细胞一大肠杆菌BJ 5183(内含腺病毒骨架质粒pAd-Easy)中，并在该菌内进行同源重组，产生包含目的基因的重组腺病毒基因组质粒，转染293细胞包装为重组腺病毒。检测病毒滴度后，进一步对重组腺病毒分别感染293和H1299细胞的结果进行IFA法检测目的基因在靶细胞中的有效表达。结果经酶切、PCR鉴定证实，穿梭质粒和重组腺病毒质粒插入片段为IL-18、AFP基因。包装的腺病毒载体具有良好的感染性，可以在293细胞中形成病毒颗粒。滴度测定结果为Ad-IL-18 2.65×109 PFU/ml；Ad-AFP采用同样方法测定的滴度为4.01×109 PFU/ml。重组腺病毒感染H1299细胞后IFA法检测结果显示目的基因表达于感染细胞中，表明腺病毒介导的IL-18、AFP基因感染的有效性。结论成功构建了复制缺陷型AFP、IL-18重组腺病毒及对照重组腺病毒Ad-GFP；重组腺病毒Ad-IL-18、Ad-AFP能高效介导基因在被感染细胞内有效表达。第二部分：肝癌患者外周血PBMC来源的树突状细胞的体外诱导及其体外感染腺病毒效率的测定目的以经动员富集的肝癌患者外周血单个核细胞（Mono nuclear cell，MNC）为来源，建立体外诱导培养DC的方法；以健康供者MNC为对照，检测肝癌DC的形态、表型及功能；利用Ad-GFP作为研究对象，测定腺病毒介导的树突状细胞的体外转染效率。方法选择肝癌患者及正常人外周血，血细胞分离机分离富集外周血MNC，经淋巴细胞分离液梯度离心、聚苯乙烯细胞培养板贴壁纯化后，加入含GM-CSF和IL-4的X-VIVO 15培养液联合诱导DC分化，诱导d6加入TNF-&促进DC成熟。分别以倒置显微镜、电子显微镜观察DC形态变化，FCM检测细胞表型变化。利用Ad-GFP作为研究对象，测定腺病毒介导的树突状细胞的体外转染效率，MTT法检测DC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力。取培养第7天的DC，按不同的MOI将重组腺病毒加入培养孔中，FCM检测细胞感染前后的表型变化以及腺病毒的感染效率。结果肝癌患者DC鉴定：诱导后，患者DC显示出典型的形态及表型特征。诱导d8(加TNF-&活化48h)，CD1a CD11c CD86 CD80、HLA-DR各抗原表达量明显升高，为典型DC表型；健康对照DC各抗原表达量比较，二者间无显著性差异(P>0.05 )。混合淋巴细胞反应结果显示，患者DC具有高效地刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力，其刺激指数( SI)与健康对照DC的SI无显著差异(P>0.05 )。用Ad-GFP感染培养的DCs时，有较好的量效关系和时效关系。当感染增殖率(multiplicity of infection, MOI)为200时，感染24小时大于70%的DCs被转染。且转染后的DCs的形态与对照组相比无明显异常。并且DC经腺病毒感染DC 24小时后，FCM检测细胞表型为成熟DC表型特征。证明Ad-GFP能高效、安全感染培养的DC。结论以肝癌患者经动员富集的外周血MNC为来源，联合应用GM-CSF、IL-4及TNF-&，在体外可诱导培养出具有典型形态、表型及免疫活性的DC。腺病毒介导的基因可在人外周血MNC来源的DC中高效表达。体外诱导抗肝癌免疫治疗的研究目的以腺病毒载体介导AFP基因与IL-18基因修饰树突状细胞，使之即表达肝癌相关抗原AFP，又表达细胞因子IL-18，从而诱导更强的AFP特异性CTLs，探讨AFP、IL－18基因修饰树突状细胞较以往AFP基因修饰DC瘤苗作为肝癌免疫治疗瘤苗是否更具优势。方法分别以Ad-IL－18、Ad-AFP以及Ad-IL-18和Ad-AFP转染DC，以western blot及ELISA法检测三组细胞基因表达，以FCM检测感染后DC表型变化。以感染Ad-IL-18、感染Ad-AFP、共感染Ad-IL-18/ Ad-AFP的DC作为刺激细胞，取患者外周静脉血单个核细胞(PBMC )中非贴壁细胞(淋巴细胞，T)，调整细胞密度为1×106/mL，以含1L-2，10%FCS的RPMI1640培养；将IL-18-DC、AFP-DC与IL-18/AFP-DC以5×104mL密度分别加入上述淋巴细胞中，共同孵育72h (设未致敏DC组和单独淋巴细胞组为对照)，再次加入同剂量DC孵育72h，收获细胞分别称为IL-18/AFP-DC-T、AFP-DC-T、IL-18-DC-T、DC-T和T。以IL-18/AFP-DC-T、AFP-DC- T、S-DC-T、DC-T和T作为效应细胞，肝癌细胞株HepG2，SMMC-7721和人肺腺癌H1299作为靶细胞，以不同效靶比接种于96孔板，4h后LDH法测定效应细胞对各肿瘤细胞的杀伤作用。结果western blot及ELISA法检测结果显示目的基因均表达于转染的三组细胞中。FCM结果显示共感染的DC细胞均高表达CD1a、CD11c、CD80、CD86和HLA-DR，表现为成熟DC表型特征。CTL结果显示IL-18/AFP-DC-T、AFP-DC-T组均显示对HepG2高效特异的杀伤活性，显著高于IL-18-DC-T、DC-T组和单纯T组，其杀伤能力与效应细胞数量成正比；IL-18/AFP-DC-T、AFP-DC-T刺激的T细胞组IFN-分泌显著高于IL-18-DC-T、DC-T组和T组；但IL-18/AFP-DC-T刺激组IFN-分泌高于AFP-DC-T而DC-T和T组IFN-分泌亦无明显区别。结论腺病毒介导AFP和IL-18基因修饰DC，能够在体外诱导特异性CTL效应，对表达AFP的肝癌细胞有明显的杀伤作用，而且对HepG2细胞杀伤率大于单独AFP基因转染DC组。