论文部分内容阅读
研究背景和目的人类RegⅠ(regenerating gene Ⅰ)基因是1个单拷贝基因,为Reg基因家族的1员,定位于2号染色体,由6个外显子和5个内含子组成。Reg蛋白的功能与抗凋亡因子、急性反应蛋白和神经细胞生长因子相似。近年的研究结果表明,RegⅠ蛋白在胃癌组织中高表达；Reg Ⅰ基因的表达与胃癌的分化程度、浸润性生长以及患者的预后均存在有相关性。胃泌素是由胃和上段小肠粘膜的G细胞分泌的一种多肽类激素,通过与膜上的缩胆囊素-B/促胃液素受体特异性结合而刺激胃酸的分泌。胃泌素与胃上皮细胞的增殖、壁细胞和ECL细胞的数量增加均有非常密切的关系,而且在胃黏膜的恶性变过程中也起着非常重要的作用。前期的研究显示,胃泌素可通过上调RegⅠ基因的表达促进胃癌细胞的生长。但是,胃泌素上调Reg Ⅰ基因表达的分子机制尚不清楚。真核细胞的基因表达由顺式作用元件(cis-acting element)和反式作用因子(trans-acting factor)相互作用而调控。顺式作用元件通常为非编码序列,可影响自身基因的表达活性。Reg Ⅰ基因内含子是否具有顺式调控功能?胃泌素能否对RegⅠ基因内含子的功能产生效应?前期的研究显示,胃癌细胞RegⅠ基因第2内含子具有顺式调控功能。在此基础上,本研究分别克隆人白细胞RegⅠ基因第1、3、4和5内含子,构建荧光素酶报告载体,转染SGC-7901胃癌细胞,检测荧光素酶活性,分析RegⅠ基因第1、3、4和5内含子的顺式调控功能。胃泌素孵育转染荧光素酶报告载体的胃癌细胞系,观察胃泌素对RegⅠ基因第1、3、4和5内含子的顺式调控功能的效应。材料与方法1.构建Reg Ⅰ基因第1、3、4和5内含子的萤光素酶报告载体应用PCR技术从人白细胞分别克隆RegⅠ基因的第1、3、4和5内含子,产物经SacⅠ/KpnⅠ双酶切后,将Reg Ⅰ基因第1、3、4和5内含子片段分别克隆入pbluescript IISK+载体,分别命名为S-intron1、SK-intron3、SK-intron4和SK-intron5。再分别亚克隆至萤光素酶报告载体pGL3-Basic,构建含Reg Ⅰ基因第1、3、4和5内含子的报告载体,分别命名为pGL3-intron1、pGL3-intron3, pGL3-intron4和pGL3-intron5。重组质粒经SacⅠ/KpnⅠ双酶切及测序鉴定。2.转染培养胃癌细胞系SGC7901。应用脂质体LipofectamineTM2000,分3组进行转染：对照组,无质粒转染；实验对照组,转染pGL3-Basic;实验组,分别转染pGL3-intron1、pGL3-intron3、pGL3-intron4和pGL3-intron5。3.荧光素酶活性检测加入1×107mol/L胃泌素孵育12h,提取细胞上清,Glomax荧光检测仪检测各组细胞胃泌素孵育前后荧光素酶活性：4.统计学分析：实验数据均采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数士标准差表示,应用单因素方差分析进行组间数据差异比较,以P<0.05为差异有显著性。结果1.构建RegⅠ基因第1、3、4和5内含子萤光素酶报告载体：pGL3-intron1、 pGL3-intron3、pGL3-intron4和pGL3-intron5经KpnⅠ/SacⅠ双酶切后,琼脂糖凝胶电泳鉴定,插入片段长度与预期一致。DNA测序显示,其序列与GenBank报道一致,且插入方向正确。2.荧光素酶活性检测：pGL3-intron1组、pGL3-intron3组、pGL3-intron4组、pGL3-intron5组和pGL3-Basic组荧光素酶活性分别为221.778±33.937、3386.556±228.544、4092.889±131.920、1256±77.444和185±14.526。实验组pGL3-intron1组与实验对照组无显著性差异(P>0.05),其余各组均明显高于实验对照组(P<0.05)胃泌素孵育后,pGL3-intron1组、pGL3-intron3组、pGL3-intron4组、pGL3-intron5组和pGL3-Basic组荧光素酶活性分别为225.778±17.726、3244.333±193.602、4099±177.464、1757.667±330.856和184.889±13.242,与孵育前无显著性差异(P>0.05)。结论1.分别转染pGL3-intron1、pGL3-intron3、pGL3-intron4和pGL3-intron5后,胃癌细胞荧光素酶活性除转染pGL3-intron1组无明显改变外,其余各组均明显升高。结果表明,除第1内含子外,RegⅠ基因第3、4和5内含子具有顺式调控功能。2.胃泌素孵育后,转染pGL3-intron3、pGL3-intron4和pGL3-intron5胃癌细胞荧光素酶活性无明显改变。结果表明,胃泌素对RegⅠ基因第3、4和5内含子的顺式调控功能无明显效应。