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2015年,我们课题组和中国科学院动物研究所陈大华组合作,证实果蝇基因组DNA上含有大量的6mA(6mA/dA,0.001~0.07%),并且其紧密调控果蝇早期胚胎发育和转座子表达。这与6mA在秀丽隐杆线虫以及哈德莱茵衣藻中的研究一起,共同表明6mA是一种新的真核基因组表观遗传印记。随后,在小鼠、斑马鱼、猪和人等高等动物基因组DNA中也检测到6mA的存在。现有少数几种检测6mA的分析方法,如超高效液相色谱串联质谱(UHPLC-MS/MS)、抗体依赖的免疫分析和DNA测序等。然而,LC-MS和抗体依赖的实验面临细菌污染的难题。DNA测序技术虽然能够通过测序结果与实验物种的基因组序列比对从而扣除来自细菌的6mA干扰,但它可能同样需要抗体富集含有6mA的DNA片段以用来测序。为此,我们开发了一种基于稳定同位素标记的脱氧腺嘌呤核苷([15N5]-dA)示踪,UHPLC-MS/MS检测的方法,来精确和快速地检测细胞基因组真实的6mA水平。 当HEK293T细胞暴露[15N5]-dA时,仅以[15N4]-dA的形式掺入基因组DNA。Q-TOF-MS的Target MS/MS模式的分析结果表明,[15N4]-dA的环外氨基上为普通的14N原子。因而,我们推测在细胞内[15N5]-dA→[15N4]_dA的生物过程可能是腺苷脱氨酶Ada介导的。 为了证实这一猜测,我们采用siRNA敲低Ada的表达,和阴性对照组相比[15N4]-dA/dA和[15N4]-dG/dG分别下降了37.2%和31.8%,表明在这一过程中Ada确实发挥了作用,但未检测到[15N5]-dA。为了证实以上结果,我们采用不同浓度的Ada抑制剂(EHNA)抑制Ada活性,发现和对照组相比[15N4]-dA/dA和[15N4]-dG/dG分别下降了75%-96.4%和75.4-96.8%,同时检测到了[15N5]-dA,但是[15N5]-dA/dA不超过5%。以上结果表明,Ada介导的嘌呤补救合成途径的确是[15N5]-dA掺入DNA的主要途径。 共生于293T细胞的支原体,既能够摄取培养基中[15N5]-dA,也能够摄取宿主核酸池中的[15N4]-dA和[15N4]-dG。然而,293T细胞主要摄取核酸池中的[15N4]-dA和[15N4]-dG。利用支原体DNA富有[15N5]-dA和[15N5]-6mA而人细胞富有[15N4]-dA和潜在的[15N4]-6mA的特点,该方法能够区分细胞是否发生支原体感染。 因为扩增自细菌的质粒无15N标记,所以质粒携带的6mA也无15N标记,因而可以采用[15N5]-dA示踪的方法将质粒DNA6mA和细胞DNA[15N4]-6mA区分开来。 利用上述原理,我们评估了细菌DNA N6-腺嘌呤甲基转移酶(Dam)在细胞内的活性。突变体DamD181N拥有较野生型Dam低约100倍的甲基转移酶活性,但采用[15N5]-dA示踪,UHPLC-MS/MS检测的方法仍然可以检测到2.8个[15N4]-6mA/106dA,即使此时存在高达≈500个6mA/106dA的背景干扰。而作为阴性对照,EGFP和DamP183R过表达均未显示甲基转移酶活性。以上结果表明,[15N5]-dA示踪能够准确地、灵敏地评价外源蛋白在细胞内DNA N6-腺嘌呤甲基转移酶活性。 鉴于一些细胞不能利用胸腺嘧啶脱氧核苷来评价细胞增殖,我们试图建立[15N3]-dC标记DNA合成来评价细胞增殖的方法。 首先,我们证实[15N3]-dC掺入小鼠胚胎干细胞基因组DNA的形式为[15N3]-dC和[15N2]-dT。当细胞暴露10μM[15N3]-dC时,[15N2]-dT/dT和细胞增殖呈正相关(0-24h),是较[15N3]-dC/dC更为理想的评价细胞增殖的指标。而在撤掉示踪剂[15N3]-dC后,[15N3]-dC/dC和[15N2]-dT/dT的对数和细胞数目的对数呈负相关,二者均是评价细胞增殖的理想指标。另外,不同[15N3]-dC的剂量和不同的细胞铺板密度影响[15N3]-dC/dC和[15N2]-dT/dT的标记比例。以上结果表明,[15N3]-dC在一定的条件下,可以用来评价细胞增殖。采用[15N3]-dC示踪的方法,我们发现Tet1-/Tet2-/Tet3-三敲的mES细胞拥有较野生型更快的细胞增殖速度。