论文部分内容阅读
猪链球菌病对养猪业发展造成极大危害，其中猪链球菌2型（SS2）为人畜共患传染病，严重威胁公共卫生安全。目前，预防和治疗猪链球菌病的主要方法是免疫接种和抗生素治疗，但是猪链球菌分群复杂，疫苗更新快，对抗生素容易产生耐药性并存在肉制品中的抗生素残留问题。卵黄抗体（IgY）不存在药物残留和耐药性的问题，是一种安全、高效、无公害的生物制品，可替代抗生素用于猪链球菌病的日常预防。本课题通过对猪链球菌2型（SS2）抗原活化扩培，制备免疫原，免疫健康临产鸡，从高免鸡蛋中提取特异性IgY，研究了IgY的热、酸碱、胃蛋白酶和胰蛋白酶稳定性以及亲和常数。为了提高IgY的耐胃酸及酶解稳定性，制备载IgY壳聚糖纳米微粒并优化条件，对微粒进行表征及体外释放性能研究。SS2免疫原制备与特异性IgY的制备。SS2菌种经显微镜镜检，活化扩培，菌落平板计数得菌体浓度为3.4×1010CFU/mL，煮沸灭活，获得SS2菌体抗原。菌体抗原与佐剂混合制成免疫原，免疫健康临产鸡，经4次免疫后，收集免疫后的高免鸡蛋（测得ELISA效价1:6400）。从高免鸡蛋中分离卵黄，采用水稀释冻融法、微滤、超滤、盐析、透析、亲和层析等纯化方法，得到IgY亲和层析样品，考马斯亮蓝G-250法检测得该IgY样品的蛋白质含量为81mg/mL，SDS-PAGE检测IgY纯度达到电泳纯，间接ELISA法检测IgY效价为1:6400。IgY的性质研究。应用间接ELESA和SDS-PAGE考察IgY对温度、酸碱、胃蛋白酶和胰蛋白酶稳定性以及亲和常数，结果表明：在温度低于60℃及pH3～10范围，IgY活性基本保持不变；在模拟胃液（SGF）中温育4h后，IgY的活性保留率仅为9.3%，表明IgY易被胃蛋白酶分解；在模拟肠液（SIF）中温育4h后，IgY的活性保留率超过90%，显示IgY对胰蛋白酶稳定；非竞争性ELISA法检测IgY样品的亲和常数为8.4×108L/mol。载IgY壳聚糖纳米微粒的制备、表征及体外释放性能检测。以三聚磷酸钠为交联剂，采用离子交联法制备载IgY壳聚糖纳米微粒，单因素试验结果表明，CS与TPP质量比在3:1～7:1的范围内时才能形成纳米微粒， IgY的初始浓度在0.5～3mg/mL范围内时，随着IgY初始浓度的增加纳米微粒的包封率降低而载药量提高。以IgY的包封率和载药量为考察指标，应用星点试验设计对壳聚糖溶液的质量浓度、壳聚糖与三聚磷酸钠质量比和IgY的质量浓度三个因素的各水平进行模型拟合和响应面分析，获得纳米微粒的最佳制备工艺：壳聚糖溶液的质量浓度0.23g/100mL，壳聚糖与三聚磷酸钠质量比3.93:1，IgY的质量浓度2.46mg/mL，包封率（93.26%）和载药量（25.64%）较高，微粒平均粒径为424nm，Zeta电位为26.20mV，经傅立叶红外光谱表征，发现该纳米微粒与IgY成功结合。在pH7.4的PBS中的持续释放时间达8d，在SGF和SIF中温育4h后的累计释放率超过了90%，表现出了良好的缓释性能。载IgY壳聚糖纳米微粒，不仅可以使IgY的口服稳定性增强，还可以使IgY的释放延缓至小肠环境中释放，提高生物利用度。本课题从SS2菌体抗原制备开始，完成了特异性IgY的分离纯化，研究了IgY的性质，IgY抗体具有较高的亲和常数，可用于SS2病的免疫预防中。采用响应面法优化载IgY壳聚糖纳米微粒的制备工艺，体外释放性能研究结果表明，载IgY壳聚糖纳米微粒具有良好的缓释性能，因此，口服IgY在预防和治疗猪链球菌病方面，将具有广阔的应用前景。