【摘 要】
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聚酮化合物是一类具有良好生物活性的天然产物,在医药和生产领域都有着广泛的应用。作为新药开发的重要来源,其结构的改造一直并持续是人们研究的热门。由于其种类繁多、结构高度复杂,利用化学手段对其进行结构改造具有较大的局限性,而基于延伸单元的组合生物合成是目前实现聚酮碳骨架改造最为高效的方法。然而,当前对于延伸单元的改造局限于简单烷基取代基,主要原因在于:作为合成砌块的延伸单元（辅酶A承载）均来自脂肪酸,
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聚酮化合物是一类具有良好生物活性的天然产物,在医药和生产领域都有着广泛的应用。作为新药开发的重要来源,其结构的改造一直并持续是人们研究的热门。由于其种类繁多、结构高度复杂,利用化学手段对其进行结构改造具有较大的局限性,而基于延伸单元的组合生物合成是目前实现聚酮碳骨架改造最为高效的方法。然而,当前对于延伸单元的改造局限于简单烷基取代基,主要原因在于:作为合成砌块的延伸单元（辅酶A承载）均来自脂肪酸,其侧链都为简单烷基、负责其上载的AT模块的选择性也局限于简单烷基。所以,理性改造AT结构域引入新颖的延伸单元或控制其底物专一性,对于扩展聚酮化合物结构多样性和实现其高效定向生产具有重要意义。本文中,以聚酮化合物Splenocin（SPN）生物合成基因中具有广泛延伸单元识别性的Spn D-AT为研究对象,对比其与自然界中88种不同AT结构域的几个关键残基,利用定点突变的技术对Spn D-AT的六个关键位点进行突变,获得18株Spn D-AT突变体。接着,我们对其进行蛋白表达、纯化和测活,通过SNAC水解实验在体外表征Spn D-AT结构域的特异性,对比野生型Spn D-AT的测活结果,我们将18种Spn D-AT突变体的测活结果大致分为了四类。此外,结合Splenocin和Antimycin的生物合成途径构建了一个Antimycin的异源表达体系,完成18种Spn D-AT重组突变株的构建,并异源回补到Ant D、Ant E缺失的脱酰基抗霉素高产菌株中,通过将其引入脱酰基抗霉素（DAs）的生物合成途径中,从而进一步在体内表征Spn D-AT结构域的特异性。结合体内和体外的数据结果,我们获得了两株高度专一的突变体Spn D-AT27和Spn D-AT28,其中Spn D-AT27只能识别并上载苄基丙二酰Co A作为延伸单元,Spn D-AT28只识别并上载短链脂肪酸包括甲基丙二酰Co A和乙基丙二酰Co A作为延伸单元。这对AT结构域的进一步改造和建立多元化的延伸单元生物合成途径奠定了基础。UK-2化合物是首个侧链含有苄基的抗霉素类抗生素,其独特的杀菌作用模式大大提高了其药用价值。由于其商业价值,我们无法获得UK-2A的原生菌株。因此,我们根据UK-2A的生物合成途径在体外构建了UK-2A的生物合成基因簇,试图建立一个UK-2A的异源表达系统,从而实现UK-2A的高效大量生产并完成其活性鉴定。
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