研究背景急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）是目前最常见的一类急性白血病。化疗依然是临床治疗AML的主要手段。但目前AML患者化疗药物治疗后的完全缓解（Completeresponse,CR）率仅为50-70%,给社会和家庭带来沉重负担。化疗耐药是AML难治复发的主要原因,寻找介导AML化疗耐药的关键分子、探究AML化疗耐药的发生机制是当前AML临床及基础研究的热点问题。表观转录组学是当今国内及国际自然科学的热点研究领域,m6A甲基化修饰则是其中最具代表性的一种化学修饰。m6A甲基化修饰系统包括“写入器”、“消除器”和“读取器”等3种组分,它们共同介导RNA特定腺苷酸的m6A甲基化修饰、去甲基化调控和功能识别等动态调节过程,是mRNA中含量最丰富的一种化学修饰,在整个基因表达过程中发挥关键的调控作用。鉴于m6A修饰的可逆性和动态性以及其对细胞分化、正常发育和人类疾病的重要作用,相关研究已经迅速成长为一个新兴的热点研究领域。METTL3作为m6A甲基化修饰系统“写入器”的一员,是核心的甲基转移酶,其主要通过m6A甲基化参与生物功能调控。目前,国内外多项研究均发现m6A甲基化与AML发病有密切关系,而METTL3介导的m6A甲基化在AML治疗中也表现出很大潜力。但是,在AML化疗耐药过程中,METTL3及其介导的m6A甲基化修饰的作用仍不为人所知。骨髓微环境学说为阐述AML化疗耐药产生机制的学说之一,即AML细胞归巢并植入骨髓（Bone Marrow,BM）以逃避化疗药物杀伤。目前围绕骨髓微环境形成以下两种AML化疗耐药模型:①可溶性因子介导的化疗耐药（Soluble factor-mediated drug resistance,SM-DR）:认为骨髓微环境内的成骨细胞、内皮细胞和基质细胞等可分泌多种可溶性因子,这些因子通过作用于AML细胞的相应受体,激活不同信号传导通路,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,介导AML化疗耐药的发生;②细胞粘附介导的化疗耐药（Cell adhesion-mediated drugresistance,CAM-DR）:认为 AML 细胞通过一系列的粘附分子及细胞外基质成分,与骨内膜或基质的成骨细胞物理性紧密结合,介导AML细胞归巢,使其藏匿于骨髓微环境中。同时,这种粘附分子介导的物理粘附作用亦可以激活系列信号级联反应,联合SM-DR共同促进AML细胞的自我更新及生存,并产生化疗耐药,成为多周期化疗缓解后复发的“罪之源”。然而,m6A甲基化修饰与AML细胞的归巢之间的关联尚未见报道。因此,本研究从转录及蛋白水平协同筛选出AML化疗耐药潜在靶基因METTL3,利用临床样本及细胞株证实METTL3与AML化疗耐药相关;并且,从体外及体内水平上阐明了 METTL3介导的m6A甲基化修饰在AML化疗耐药中发挥的作用;进一步地,我们明确了 METTL3及m6A甲基化修饰与AML细胞归巢及植入的关系,并探究了METTL3-m6A-ITGA4轴的具体作用机制。本研究对明确AML化疗耐药的发生机制至关重要,也将极大地促进METTL3在难治/复发AML治疗领域的临床应用,不仅可以为AML的化疗耐药机制提供新的理论,也可为难治/复发AML的治疗供新的思路。研究目的1.筛选并明确AML化疗耐药的潜在靶点基因,分析METTL3在AML化疗耐药细胞中的表达,探究METTL3是否促进AML化疗耐药,以及METTL3是否依赖于其m6A甲基转移酶功能促进AML化疗耐药,为难治/复发AML的治疗提供新思路和分子研究基础。2.探究METTL3通过m6A甲基化修饰促进AML化疗耐药的潜在下游机制,解析METTL3及m6A与AML细胞归巢的关系,证实METTL3是否通过介导AML细胞归巢介导化疗耐药的发生。3.阐明METTL3调控AML细胞归巢的具体机制,明确METTL3通过介导m6A甲基化修饰调控的特定下游分子,明晰METTL3调节的下游分子中m6A甲基化修饰的关键位点及调节机制。研究方法第一章METTL3可促进AML化疗耐药1.RNA 测序（RNA-Sequencing,RNA-Seq）及反相蛋白阵列（Reversed-phase protein array,RPPA）联合分析:利用GEO公共数据库GSE165430数据集中的RNA-seq数据分析268例正常核型且后续诱导化疗后达完全缓解（Completeremission,CR）的AML初诊患者样本,按最终结局将其分为复发组（n=164）及持续CR组（n=104）,分析复发组与持续CR组的差异基因。同时,为了缩小与AML化疗耐药相关的靶基因列表,我们利用RPPA技术对THP-1细胞及IDA持续诱导得到的THP-1/IDA化疗耐药细胞进行潜在药物靶点蛋白差异分析,筛选得到AML化疗耐药细胞与AML化疗敏感细胞的差异蛋白,与RNA-Seq结果取交集得到转录及蛋白水平均发生变化的关键靶基因。2.临床样本的收集、处理与检测:收集初诊及复发的AML患者的骨髓液,利用Ficoll密度梯度离心法对骨髓单个核细胞（BMMNCs）进行分离和收集。利用CD34磁珠分选并富集CD34阳性细胞,提取RNA。qRT-PCR检测患者骨髓中METTL3表达,m6A甲基化ELISA试剂盒检测m6A甲基化修饰水平。3.细胞系培养、AML化疗耐药细胞诱导及METTL3表达水平检测:人白血病细胞系THP-1及HL-60/ADR由含10%FBS的RPMI-1640完全培养基培养;Kasumi-1及HL-60由含20%的IMDM为基础的完全培养基培养;人胚肾细胞系293T使用含10%FBS的DMEM为基础的完全培养基培养。利用IDA浓度递增法诱导THP-1及Kasumi-1细胞,得到AML化疗耐药细胞株THP-1/IDA及Kasumi-1/IDA。收集THP-1、Kasumi-1、THP-1/IDA、Kasumi-1/IDA、HL-60 及 HL-60/ADR 细胞,qRT-PCR、Western blot 及流式细胞术法检测METTL3的表达水平。4.m6A甲基化修饰水平检测:利用m6A dotblot及液相色谱质谱联用（LC-MS/MS）手段,分析AML化疗耐药细胞及敏感细胞中m6A甲基化修饰水平差异。5.病毒转染及稳筛:①dCas9稳定细胞系:转染dCas9-vp64-puro慢病毒,然后用2 mL含有嘌呤霉素的完全培养基替换。将筛选稳定的细胞用gMETTL3-GV419-Neo及其阴性对照慢病毒进行二次转染,然后用G418进行筛选处理。将THP-1-dCas9-gMETTL3和Kasumi-1-dCas9-gMETTL3单细胞接种于96孔板中进行单细胞克隆增殖,利用Western blot验证过表达效率。②慢病毒转染稳筛细胞株:将METTL3过表达,METTL3甲基转移酶催化功能突变体METTL3-CD进行慢病毒包装并转染到THP-1和Kasumi-1细胞中,加入嘌呤霉素进行稳定筛选后扩大培养。利用Western blot验证过表达效率及其促进m6A甲基化修饰的能力。6.药物敏感性检测:利用EdU增殖实验,分别检测PBS及IDA药物压力下各组AML细胞进入细胞分裂周期的比例;通过克隆形成实验,检测PBS和IDA药物处理24 h后各组细胞长期培养后的集落数量变化;通过流式凋亡实验,检测IDA药物处理后,各组细胞的凋亡情况。7.动物实验:构建AML小鼠模型:①AML细胞株构建的异种移植模型:用THP-1细胞经尾静脉注射植入NOD-SCID-IL2rg（NSG）小鼠;②MLL-AF9同种移植模型:用包装携带MSCV-MLL-AF9载体的逆转录病毒感染C57BL/6小鼠骨髓c-Kit+细胞,筛选培养7天后扩增形成细胞系后将MLL-AF9细胞分别经尾静脉注射植入C57BL/6小鼠体内进行造模。分别给予化疗药物治疗后,利用活体成像技术分析各组AML小鼠肿瘤负荷,流式细胞术分析各组AML小鼠骨髓、脾脏内的AML细胞比例,分析各组脾脏重量,HE染色分析各组肝脏浸润情况,生存曲线分析各组AML小鼠生存情况。③患者来源的异种移植模型（patient-derived xenografts,PDXs）:利用患者骨髓CD34阳性细胞通过鼠尾静脉注射植入NSG小鼠进行PDXs模型构建,给予化学药物治疗后进行流式细胞术检测骨髓负荷,分析METTL3高表达患者组及低表达患者组小鼠的化学药物敏感性差异。8.METTL3抑制剂逆转耐药实验:对AML敏感株及相应化疗耐药株进行STM2457处理48h后,m6A dotblot检测各组细胞的m6A甲基化修饰水平变化,EdU检测各组药物敏感性变化;IDA与STM2457联合治疗THP-1/IDA构建的AML模型小鼠,流式细胞术检测小鼠骨髓肿瘤细胞负荷变化。9.统计分析:使用GraphPad Prism 9.0或R语言进行统计分析。采用非配对t检验和相关检验对两组资料进行分析,采用双向方差分析比较两组指标间、内差异;Kaplan-Meier生存曲线,使用log rank检验计算P值,P＜0.05时被认定为差异具有统计学意义。第二章METTL3通过促进AML归巢介导化疗耐药1.m6A-Seq及RNA-Seq测序:将THP-1及METTL3过表达的THP-1细胞进行扩增,分别取处于对数生长期的各组细胞1×106个,PBS洗涤后获得细胞沉淀,加入Trizol后,干冰保存送至上海伯豪生物有限公司进行转录组测序。2.基因富集分析（Gene set enrichment analysis,GSEA）:利用 GSEA 富集分析,分析并明确METTL3过表达后m6A甲基化修饰及转录水平均发生变化的下游分子及通路。3.迁移与粘附实验:通过与HUVECs共培养进行的Transwell迁移试验和细胞粘附实验,检测METTL3、METTL3-CD过表达及对照组AML细胞的迁移及粘附能力。4.AML细胞归巢及植入能力检测:利用AML异种移植模型及同种移植模型,利用流式细胞术分析模型构建16h后METTL3、METTL3-CD过表达及对照组小鼠骨髓及脾脏内AML细胞的归巢情况,42天（异种移植模型）/7天（同种移植模型）分析AML细胞的植入情况。免疫组织化学染色法检测AML细胞骨髓归巢情况。5.METTL3抑制剂逆转迁移/粘附及归巢/植入实验:利用STM2457处理AML敏感株及相应化疗耐药株48 h后,分析各组细胞迁移及粘附能力变化;利用STM2457处理后的THP-1及THP-1/IDA构建的模型小鼠,16h后流式细胞术检测小鼠体内AML细胞归巢情况,42天检测小鼠体内AML细胞植入情况。第三章METTL3通过调控ITGA4介导AML归巢及化疗耐药1.METTL3与ITGA4表达相关性分析:利用TCGA数据库,临床样本及AML细胞株,通过qRT-PCR,Western blot,流式细胞术及免疫荧光技术从转录及蛋白水平分析METTL3与ITGA4的表达相关性。2.ITGA4抑制剂拮抗实验:使用ITGA4抑制剂TR-14035对METTL3过表达及其对照组的细胞进行处理,检测其迁移、粘附能力及化疗药物敏感性变化。3.MeRIP-qPCR检测:选择生长状态良好的、处于对数生长期的METTL3过表达及其对照组的THP-1、Kasumi-1细胞,通过RNA提取、RNA打断及m6A抗体富集,利用qRT-PCR技术检测METTL3能否调控ITGA4 mRNA的m6A甲基化修饰。4.双荧光素酶报告基因分析:分析METTL3能否与ITGA4 mRNA 3’UTR的潜在m6A甲基化修饰位点直接结合。5.mRNA半衰期检测:放线菌素D以终浓度5 mg/mL处理各组细胞后收集,提取RNA,用qRT-PCR检测并计算各组mRNA半衰期。研究结果第一章METTL3可促进AML化疗耐药1.METTL3可促进AML细胞化疗耐药1.1 METTL3为AML化疗耐药的潜在靶基因:我们首先得到1184个在复发组患者中表达升高的潜在靶基因,进一步地,利用RPPA分析发现有44个蛋白在THP-1/IDA细胞中显著升高。mRNA及蛋白表达水平变化联合分析后,PDGFRB、METTL3和IGFBP2被确定为与AML化疗耐药相关的候选基因。最终,选择与AML化疗耐药关系未知的METTL3作为难治性/复发性AML的潜在临床治疗靶点进行进一步的研究。1.2 AML化疗耐药细胞中METTL3表达增多:本研究收集的临床样本中METTL3在难治性/复发组中的表达水平明显高于CR组,表明METTL3与AML预后相关。利用AML化疗敏感细胞及耐药细胞分析发现METTL3在AML化疗耐药细胞中高表达,表明METTL3与AML化疗耐药相关。1.3 METTL3过表达可促进AML细胞化疗耐药:EdU增殖实验证实,无论是PBS还是IDA药物压力下,METTL3过表达组AML细胞进入细胞分裂周期的比例较NC组均显著增多,且IDA药物压力下METTL3过表达组细胞的促增殖能力更加显著。克隆形成实验证实,PBS和IDA药物处理24h后,METTL3过表达组的长期增殖能力较NC组显著增强,且IDA药物处理后此促增殖能力更为显著。2.METTL3可通过介导m6A甲基化修饰促进AML细胞化疗耐药2.1 AML化疗耐药细胞中m6A甲基化修饰水平升高:m6A甲基化ELISA试剂盒检测发现,难治/复发组AML患者骨髓样本的m6A甲基化修饰水平较CR组显著增多。m6A dot blot及LC-MS/MS证实,AML化疗耐药细胞中mRNA的m6A甲基化修饰水平较AML化疗敏感细胞显著升高,表明AML化疗耐药细胞中m6A甲基化修饰增多。2.2 METTL3-CD突变体的构建及m6A甲基转移酶功能验证:Western blot验证慢病毒转染成功后,m6A dot blot证实METTL3可显著促进AML细胞m6A甲基化修饰形成,而METTL3-CD的促m6A甲基化修饰形成能力丧失。2.3 METTL3可通过介导m6A甲基化修饰促进AML细胞耐药:EdU增殖实验及克隆形成实验证实METTL3可增强AML化疗耐药,且此种能力依赖其m6A甲基化修饰催化活性;凋亡实验证实METTL3可降低AML细胞的化学药物敏感性,而METTL3-CD与对照组无差异。3.体内研究证实METTL3可通过介导m6A甲基化修饰促进AML化疗耐药3.1在异种小鼠模型中METTL3通过m6A甲基化修饰促进AML化疗耐药:异种移植模型中,METTL3可显著降低AML模型小鼠对化疗药物的敏感性,增加了化疗药物治疗后AML小鼠的骨髓、脾脏及肝脏肿瘤负荷,缩短其生存期,而METTL3-CD组小鼠与对照组小鼠无统计学差异,证实METTL3可在体内水平上通过促进m6A甲基化修饰形成介导AML细胞耐药。通过对PDXs模型进行化学药物治疗证实METTL3高表达组患者组小鼠的化学药物敏感性较METTL3低表达组降低。3.2在同种移植模型中METTL3通过m6A甲基化修饰促进AML化疗耐药:同种移植模型中,METTL3可显著降低AML模型小鼠对化疗药物的敏感性,增加了化疗药物治疗后AML小鼠的骨髓、脾脏及肝脏肿瘤负荷,缩短其生存期,证实METTL3可在体内水平上通过促进m6A甲基化修饰形成介导AML细胞耐药。4.STM2457可提高AML化疗耐药细胞的化疗药物敏感性通过m6A dot blot检测发现,STM2457抑制剂处理48 h后,AML化疗耐药细胞的m6A甲基化修饰水平显著降低,STM2457抑制剂显著抑制AML化疗耐药细胞的增殖,并促进其凋亡。STM2457预处理的THP-1/IDA异种移植小鼠在IDA处理后骨髓和脾脏中AML细胞浸润较对照组少,提示STM2457预处理可提高AML化疗耐药细胞的IDA治疗敏感性。第二章METTL3通过促进AML归巢介导化疗耐药1.METTL3通过介导m6A甲基化修饰促进AML细胞迁移及粘附1.1 METTL3通过介导m6A甲基化修饰调控迁移及粘附相关通路:m6A-seq数据显示,在METTL3过表达后,3516个基因的m6A修饰水平显著增加。通过与RNA-seq数据的综合分析,确定了 564个转录组范围内的潜在靶分子。通过GSEA富集分析确定了10条m6A修饰水平及转录水平均发生上调和下调的基因所富集的通路,发现METTL3过表达显著激活了迁移和粘附相关的信号通路。此外,METTL3过表达组在涉及迁移/粘附相关通路的富集基因转录本上有更高的m6A甲基化修饰丰度。1.2 METTL3可促进AML细胞迁移及粘附:过表达METTL3的AML细胞聚集性生长;通过与HUVECs共培养进行的Transwell迁移试验和细胞粘附实验,证实METTL3可促进AML细胞的迁移和粘附,而METTL3-CD则丧失了这种功能。2.体内研究证实METTL3通过介导m6A甲基化修饰促进AML细胞归巢及植入2.1在异种移植模型中METTL3通过m6A甲基化修饰促进AML细胞归巢及植入:流式细胞术证实尾静脉注射后16 h及42天时,METTL3的表达增加了骨髓和脾脏中AML细胞的比例,而METTL3-CD组与NC组无差异,证实了 METTL3通过m6A修饰增加了骨髓中AML细胞的归巢和植入;免疫组织化学染色证实16 h骨髓局部AML细胞归巢情况。2.2在同种移植模型中METTL3通过m6A甲基化修饰促进AML细胞归巢及植入:尾静脉注射后,流式细胞术分别检测16 h及7天时骨髓和脾脏中AML细胞的分布情况,证实METTL3的表达增加了骨髓和脾脏中AML细胞的比例,而METTL3-CD组与NC组无差异,证实了 METTL3通过m6A修饰增加了骨髓中AML归巢和植入。3.STM2457可抑制AML化疗耐药细胞的归巢及植入AML化疗耐药细胞的迁移和粘附较AML敏感细胞增强,而STM2457可逆转AML化疗耐药细胞的迁移及粘附增强。此外,STM2457的预处理逆转了 AML模型小鼠中化疗耐药细胞的归巢及植入增强。第三章METTL3通过调控ITGA4介导AML归巢及化疗耐药1.METTL3可促进ITGA4的表达通过分析迁移、粘附相关通路筛选得到潜在下游靶基因,与增殖通路共同取交集得到AML细胞归巢经典分子ITGA4。TCGA数据库,临床样本及细胞株证实METTL3可促进ITGA4的表达。2.METTL3通过ITGA4促进AML细胞的迁移、粘附及耐药2.1 METTL3通过ITGA4促进AML细胞的迁移及粘附:ITGA4抑制剂TR-14035拮抗ITGA4可阻断METTL3的促迁移、粘附作用。2.2 METTL3通过ITGA4促进AML细胞的耐药:ITGA4抑制剂TR-14035拮抗ITGA4可阻断METTL3的促化疗耐药作用,单独过表达ITGA4可促进AML细胞的化疗耐药。3.METTL3通过m6A甲基化修饰延长ITGA4的半衰期3.1 ITGA4 mRNA的m6A甲基化修饰区域及潜在位点的确定:分析m6A-Seq测序数据,明确修饰发生在CDS近3’UTR区域;Motif分析确定m6A甲基化修饰位点序列;根据Motif设计引物,MeRIP-qPCR证实METTL3可调控ITGA4 mRNA的m6A甲基化修饰;双荧光素酶报告基因系统实验证实,METTL3可与ITGA4 mRNA 3’UTR的潜在m6A修饰位点直接结合,介导ITGA4 mRNA的m6A甲基化修饰增多。3.2 METTL3可延长ITGA4 mRNA的半衰期:METTL3可延长ITGA4的半衰期,进而影响ITGA4的表达,促进AML细胞骨髓归巢及化疗耐药的发生。研究结论METTL3通过调控ITGA4 mRNA的m6A甲基化修饰,延长其半衰期并促进其表达,从而促进AML细胞归巢并介导化疗耐药。