实验目的：药对是中药复方配伍中最简单、最基本的用药形式，药对配伍的研究是复方配伍规律研究的基础和重要切入点0之一，本研究以经典的寒热配伍为主的黄连、吴茱萸药对为研究对象，通过分析不同配伍比例药对中指标性成分的含量、药效作用和药代动力学差异，探讨黄连、吴茱萸药对的配伍机制，为应用黄连、吴茱萸药对配伍的现代制剂的物质基础研究，提供工作基础和理论依据。　　 实验结果：　　 1、从化学成分含量测定和药效作用两个方面，研究黄连、吴茱萸药对的提取方法和其配伍比例。采用酸性染料比色法测定药对中总生物碱的含量，HPLC—UV法测定药对中指标性成分的含量，以治疗胃溃疡为研究对象，建立了抗胃酸分泌实验和抗溃疡实验模型，研究黄连、吴茱萸药对10个不同配伍比例(1：1～10：1)中化学成分含量和药效作用差异，试验结果表明，黄连吴茱萸药对配伍比例6：1时，总生物碱含量最高，各指标性成分含量最高，抗胃酸分泌实验和抗溃疡实验效果最好，综合分析，确定黄连、吴茱萸药对的最佳配伍比例是6：1。采用HPLC梯度洗脱色谱法，建立了黄连、吴茱萸药对不同配伍比例的色谱指纹图谱，确定18个共有峰，并对其中5个色谱峰进行了指认，和黄连、吴茱萸单味药材相比较，不同配伍比例的HPLC色谱指纹图谱无新成分产生。　　 通过均匀设计试验和正交设计试验，以浸膏率、总生物碱含量、指标性成分含量评价指标，确定黄连、吴茱萸最佳药对(配伍比例6：1)的最佳提取工艺是采用70％乙醇为溶剂，每次8倍溶剂量，提取2次，每次2h；建立HPLC色谱法，梯度洗脱，同时测定最佳药对中5种指标性成分的含量。　　 2、采用HPLC法测定血浆中盐酸小檗碱的含量。色谱柱：Diamonsil C18(150mm×4.6mm，5μm)，流动相：乙腈—甲醇—0.05mol·L-1磷酸二氢钾溶液(20：10：70)，流速：1.0mL·min-1，检测波长：345nm，柱温：35℃。血浆中盐酸小檗碱的线性范围是0.0044-0.088μg/ml，最低检测限是0.002μg/ml。大鼠分别灌胃给药盐酸小檗碱单体、黄连提取物、最佳药对提取物，三者所含盐酸小檗碱量相同，比较大鼠血浆中盐酸小檗碱的药代动力学差异，三者的药时曲线通过房室模型和非房室模型分析，均为一房室模型。对药代动力学数据采用spss11.0统计软件分析，结果显示，大鼠灌胃药对提取物后盐酸小檗碱的Cmax，MAT与大鼠灌胃黄连提取物、盐酸小檗碱单体的Cmax，MAT有显著差异，大鼠灌胃黄连提取物后盐酸小檗碱的Cmax，MAT与大鼠灌胃盐酸小檗碱单体的Cmax，MAT无显著差异。大鼠分别灌胃药对提取物、黄连提取物、盐酸小檗碱单体后盐酸小檗碱的其他药代动力学参数无统计学意义。　　 3、采用HPLC法测定组织中盐酸小檗碱的含量，色谱柱：Diamonsil C18(150mm×4.6mm，5μm)流动相：乙腈：水(45：55，每100ml流动相含0.34g磷酸二氢钾和0.17g十二烷基硫酸钠(SDS))，流速1.0 mL·min-1，检测波长：265nm，柱温：35℃，进样量：20μl。组织中盐酸小檗碱的线性范围是0.000793-0.1764μg/g，比较大鼠分别灌胃给药盐酸小檗碱单体、黄连提取物、最佳药对提取物后0.5h，1.0h，6.0h大鼠组织中盐酸小檗碱分布的差异。数据结果采用spss11.0统计软件分析，结果表明：大鼠灌胃药对提取物后0.5h，胃和脾组织中盐酸小檗碱的浓度与大鼠灌胃黄连提取物、盐酸小檗碱单体的盐酸小檗碱浓度相比有差异；大鼠灌胃药对提取物后1.0h，肝、脾、肾组织中盐酸小檗碱的浓度与大鼠灌胃黄连提取物、盐酸小檗碱单体后盐酸小檗碱浓度相比有差异；大鼠灌胃药对提取物后6.0h，肝、脾、肾、胰、小肠、睾丸组织中盐酸小檗碱的浓度与大鼠灌胃黄连提取物、盐酸小檗碱单体后盐酸小檗碱浓度相比有差异，其他组织分布三者之间无差异。　　 4、采用HPLC法测定尿样、粪样中盐酸小檗碱的含量，尿样、粪样色谱条件为色谱柱：Diamonsil C18(150mm×4.6mm，5μm)，流动相：乙腈—甲醇—0.03mol·L-1磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH=3.5)(35：10：55，每100ml流动相中含有0.1gSDS)，流速：1.0mL·min-1，检测波长：345nm，柱温：35℃。比较分别给药盐酸小檗碱单体、黄连提取物、药对提取物后，大鼠尿样、粪样中盐酸小檗碱的排泄差异。数据结果采用spss11.0统计软件分析，结果表明：大鼠灌胃药对提取物与大鼠分别灌胃盐酸小檗碱单体、黄连提取物的尿样排泄数据在0—4h、0—12、0—48～0—72h有差异，大鼠灌胃黄连提取物的尿样排泄数据与大鼠灌胃盐酸小檗碱单体的尿样排泄数据在所有采集时间段内差异小。大鼠分别灌胃药对提取物、黄连提取物、盐酸小檗碱单体的粪样排泄数据，三者之间有差异。　　 5、采用LC-MSn测定尿样中代谢物成分和种类，比较分别给药盐酸小檗碱单体、黄连提取物、药对提取物后，大鼠尿样中代谢产物的差异。结果表明：盐酸小檗碱单体灌胃给药后的代谢物检测到小檗碱原型和5个代谢产物，其中一相代谢产物1个，二相代谢产物4个。黄连提取物灌胃给药后的代谢物检测到小檗碱原型和10种代谢产物。其中一相代谢产物1个，二相代谢产物9个。药对提取物灌胃给药后的代谢物检测到小檗碱原型和10个代谢产物。与黄连提取物给药后的代谢产物比较，口服给药药对提取物后的代谢产物在种类和数量上都无差异，只是代谢产物的量有所差异。采用HPLC梯度洗脱色谱法，比较空白尿样、盐酸小檗碱单体、黄连提取物、最佳药对提取物与大鼠分别灌胃盐酸小檗碱单体、黄连提取物、最佳药对提取物的尿样指纹色谱图，结果表明，给药后尿样中盐酸小檗碱大部分以代谢物形式排泄，从色谱图上可以发现存在于20～40min时间段，盐酸小檗碱原形在尿样中含量较少。　　 实验结论：　　 1、血浆中盐酸小檗碱药代动力学数据表明，黄连药材中其他成分对盐酸小檗碱的药代动力学行为没有影响，黄连与吴茱萸配伍后盐酸小檗碱的药动学行为有一定的改善，Cmax提高，MAT缩短，大鼠灌胃药对提取物后盐酸小檗碱的Cmax是大鼠灌胃黄连提取物、盐酸小檗碱单体的1.8倍；大鼠灌胃药对提取物后盐酸小檗碱的MAT是大鼠灌胃黄连提取物、盐酸小檗碱单体的0.5倍。说明吴茱萸药材有可能促进盐酸小檗碱的吸收和排泄。　　 2、组织中盐酸小檗碱分布结果表明，盐酸小檗碱在体内组织中分布广泛，黄连与吴茱萸配伍后，促进盐酸小檗碱在胃和脾组织的吸收，促进盐酸小檗碱在小肠、肝、脾、肾、胰、睾丸组织中的代谢。　　 3、尿样中盐酸小檗碱的累计排泄量及占给药剂量中盐酸小檗碱量的百分比数据结果表明，黄连药材中其他成分对盐酸小檗碱在尿样中的排泄无影响。黄连与吴茱萸配伍后，盐酸小檗碱的尿样累计排泄量是大鼠灌胃黄连提取物或盐酸小檗碱单体的尿样累计排泄量1.18倍，吴茱萸药材与黄连药材配伍后，能促进盐酸小檗碱在体内的排泄。粪样中盐酸小檗碱的累计排泄量及占给药剂量中盐酸小檗碱量的百分比数据结果表明，黄连药材、吴茱萸药材能改善盐酸小檗碱在胃肠道的吸收，盐酸小檗碱以粪便排泄方式为主。　　 4、比较大鼠分别灌胃盐酸小檗碱单体、黄连提取物、最佳药对提取物后血浆中盐酸小檗碱的药代动力学差异，组织分布、尿样、粪样的排泄差异，研究结果表明，黄连中其他成分对盐酸小檗碱在体内的吸收、分布、排泄、代谢无显著影响，但是，吴茱萸药材与黄连药材配伍后，对盐酸小檗碱在机体内的吸收、分布、排泄、代谢有一定影响，说明吴茱萸药材有改进盐酸小檗碱的吸收、分布、排泄、代谢的作用，二者配伍有一定科学意义。