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猪圆环病毒2型(PCV2)引起的猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)是危害当今全球养猪生产的最重要的免疫抑制性疫病。目前仍没有防治该病的理想疫苗和药物,因此研究预防和治疗PCVAD的新制剂具有重要的理论和实践意义。RNA干扰(RNAi)是由双链小干扰(siRNA)引起的序列特异性的转录后基因沉默现象,该技术在传染性疾病、恶性肿瘤、心血管疾病等的治疗研究领域发展极为迅速。本研究构建了PCV2特异的siRNA表达质粒,分析了其对PCV2增殖和致病性的抑制作用。针对PCV2的rep和cap基因,筛选了10个siRNA靶序列,设计并合成了10对编码PCV2特异的shRNA的DNA寡核苷酸和1对PCV2非特异(SCR)的shRNA的DNA寡核苷酸。将11对DNA寡核苷酸退火形成双链,克隆到siRNA表达质粒pGensil-1的U6启动子下游,构建了PCV2特异的siRNA表达质粒(pGensil-C123、C297、C490、C563、C645、R148、R259、R295、R484、R601)和对照质粒(pGensil-SCR)。在脂质体介导下将构建的siRNA表达质粒转染PK-15细胞,20 h后感染500 TCID50的PCV2。应用实时荧光定量PCR(Real-time FQ-PCR)、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白免疫印记(Western-blot)和免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)等技术检测病毒DNA、mRNA及蛋白的合成与表达情况。结果表明,构建的PCV2特异的siRNA表达质粒均能不同程度地抑制PCV2 DNA、mRNA及Rep与Cap蛋白在PK-15细胞内的合成,其中针对C297、C490和R259三个靶位的siRNA的抑制效果更好。进一步研究发现,质粒转染后16 h即可抑制PCV2的复制,且直到接毒后72 h仍有明显的抑制作用;当siRNA表达质粒的转染剂量为1μg时,病毒DNA浓度显著低于转染0.25μg、0.5μg时的浓度;针对两个或三个靶位的siRNA表达质粒混合转染PK-15细胞对PCV2的抑制作用显著增强。上述结果提示PCV2特异的siRNA表达质粒对病毒的抑制作用具有长效性和剂量依赖性,针对不同靶位的siRNA表达质粒混合转染对PCV2具有抑制协同效应。将128只8周龄BALB/c随机分为8组,每组16只。第1、2组分别为只感染病毒的阳性对照(PC)组和不感染病毒的阴性对照(NC)组;第3、6组分别为空质粒和SCR对照组,第4、5组为接种一种质粒组,第7、8组为两种质粒混合组。其中第3~7组先接种质粒24 h后感染PCV2;第8组先感染PCV2,24 h后接种质粒。质粒和病毒均通过腹腔与鼻腔途径接种,质粒接种剂量为50μg/只,PCV2(105 TCID50/0.1 mL)的感染剂量为0.1 mL/只。结果PCV2感染21 d后,接种siRNA表达质粒的各组小鼠的体重均显著高于PC、空质粒和SCR对照组的体重(P<0.05),混合质粒组的体重较单质粒组的高(P>0.05)。与PC、空质粒和SCR对照组相比,接种siRNA表达质粒组的抗体水平、血清中PCV2核酸检出率以及组织中的PCV2载量均显著降低(P<0.01)。淋巴结和脾脏的淋巴细胞减少、多核巨嗜细胞浸润等显微病变轻微,到感染后21 d恢复正常。与接种一种siRNA表达质粒相比,混合质粒对PCV2在小鼠体内的增殖及其致病性的抑制效果更好。PCV2感染前较感染后接种siRNA表达质粒的小鼠组织中的病毒载量低,提示PCV2感染前使用siRNA表达质粒对病毒的抑制效果更佳。应用PCR对组织中siRNA表达质粒的检测结果表明,质粒能够在小鼠体内长期稳定存在(至少能存在28 d)。综上所述,本研究证明基于质粒表达的PCV2特异的siRNA能够在体内和体外有效抑制PCV2的增殖,显著降低PCV2的致病性,针对不同靶位的siRNA的抑制作用存在差异,不同siRNA的抑制效果具有协同作用,siRNA表达质粒能够在组织中长期稳定表达siRNA,发挥抑制效果。这些结果为进一步研发防治PCVAD的新制剂提供了科学依据。