研究背景：现代白内障囊外摘除联合人工晶状体植入技术已日趋成熟,随着手术技术及设备条件亦逐步改善,越来越多的白内障患者因此而受益。但现代白内障囊外摘除术术后的后囊膜混浊(PCO),亦即白内障术后后发障的形成,仍是成功的白内障复明术后视力再次受损的主要原因之一。虽然现代手术术中术后采取多种方式,如囊膜抛光、改变人工晶体材料及形状设计、前后囊膜联合切开、应用抑制细胞增殖药物等,一定程度上降低了后发障的发生率,但后发障的发生仍是影响术后效果重要并发症。研究表明,64岁以上老年性白内障人工晶体植入术后3年累计后发障的发生率可达38.5%,而在在儿童及青少年,其发生率几乎可达到100%。后发障形成后,虽然绝大部分患者可通过眼外Nd:YAG (Neodymium-dopedYttriumAluminiumGarnet)激光切开而再次恢复视力,但YAG激光所引起的人工晶体损伤、眼压升高、脉络膜损伤、视网膜损伤、黄斑区水肿等并发症亦不容忽视。目前认为,后发障的形成主要与晶状体本身组织特点及手术操作有关,现代白内障囊外摘除术需打开晶状体前囊,该过程将会启动晶状体的创伤修复反应,使残余的晶状体上皮细胞(LECs)在囊袋中增殖、迁移、间质纤维化,造成包括剩余的部分前囊膜及全部的后囊膜区域发生皱缩、混浊,部分晶状体上皮细胞还会发生移行后附着在人工晶体表面,并发生增殖造成局部混浊,从而形成后发障,导致视力再次受损。可以明确的说,后发障的形成源于晶体上皮细胞的异常增生,能够抑制或杀伤异常的增生晶状体上皮细胞,则就可以防止后发障的形成。如何有效抑制晶状体上皮细胞增殖,则是预防后发障发生的根本及关键所在。目前虽然已经有多种技术、材料、方法及药物应用于后发障预防的临床及实验研究,但均未达到十分理想效果。自杀基因／前药系统是近年来分子生物学领域研究热点之一,最初应用于恶性肿瘤的治疗,应用较多且研究较为成熟的有单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鸟苷(HSV-tk/GCV)系统、大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)系统等,因其可对非正常增殖细胞的特异性杀伤作用引起眼科工作者关注,已有实验证明自杀基因/前药系统可特异性杀伤增殖的晶状体上皮细胞,其作用原理为本身无细胞毒性或细胞毒性较低的前体药物能够选择性作用于被自杀基因转染的靶细胞上,在目的基因表的产物的作用下,前体药物能够转化为细胞毒性物质,从而实现对靶细胞的特异性杀伤。采用该方式杀伤异常增殖的细胞具有选择性强、特异性高、效果肯定等有点,但选择此种治疗方式有几个关键点,其一为基因载体的选择,其二杀伤性的作用强度,其三为对正常组织的影响。目前可选择的基因载体多为病毒或质粒,病毒载体转染效率较高但存在对外源基因容纳量小、稳定性差、会引起免疫系统反应等缺点,而质粒稳定性虽然较好、不会引发免疫反应,但存在表达时间短、转染效率较低等缺点,如何有效提升安全性、杀伤性与稳定性,是困扰转基因技术特异性杀伤细胞的主要问题。本研究拟以质粒为载体,联合使用HSV/GCV、CD/5-FC两种自杀基因/前药系统,同时将CD与TK两种自杀基因转染体外培养的永生化人晶状体上皮细胞,单独或联合使用不同浓度的前体药物,研究同一载体两种基因联合转染组织细胞的可行性,同时掌握一般实验室条件下永生化细胞株的复苏、培养与基因转染技术,深入探讨不同浓度或不同浓度组合的前体药物对目的基因转染后的细胞的杀伤作用,评估质粒载体及双自杀基因联合转染优缺点。以期通过体外实验的方式,对PCO的防治提供新途径与新思路。本研究分为三个部分：第一部分：质粒载体的转化与目的基因的表达目的：探讨质粒载体能否成功接入并表达目的基因方法：使用LB培养基溶化冻存之大肠杆菌DH5α菌液,CaCl2处理法制备感受态细菌后,加入连接后的pMD18-T-UL57质粒(PWZL质粒))载体,采取离心重悬菌体常规培养。选取优秀单菌落接种到Amp的LB液体培养基中，OMEGA试剂盒步骤分布提取质粒,BioPhotometer型微量核酸定量仪测量其浓度,确定CD、TK基因引物序列,PCR方法扩增并鉴定CD、TK基因,以CD、TK条带的密度与内参照管家基因的密度比值代表基因表达的相对水平,以单纯脂质体导入组作为对照,半定量分析测定CD与TK在24h、48h、72h的表达量。结果：经PCR反应,1%琼脂糖电泳可见CD、TK基因表达条带,半定量分析24小时、48小时、72小时均可测出CD、TK基因在质粒中表达,且表达量明显高于脂质体组。结论：本研究选用的质粒作为载体,可成功接入并表达目的基因CD及TK,但基因表达时间相对较短,在基因转染72小时时后均呈现明显下降趋势。第二部分：晶状体上皮细胞的体外培养与质粒转染目的：探讨可表达目的基因的质粒能否成功转染晶状体上皮细胞方法：对深低温冻存之永生化人晶状体上皮细胞株SRAO1/04进行解冻、复苏,20%胎牛血清与80%DMEM培养液中常规传代培养,取传代培养至细胞密度在70%～80%时进行以脂质体为介导进行质粒转染。经质粒转染的晶状体上皮细胞进行总RNA的提取,两步法RT-PCR检测CD、TK基因的mRNA表达；并于24小时、48小时、72小时分别行半定量分析,对CD和TK基因的表达情况行量化测定,观察各时间点的基因表达情况。结果：质粒转染后LECs继续培养,光镜可见细胞生长态势良好,形态无改变,细胞密度呈逐渐增加趋势。24h后以CD/TK条带的密度与内参照管家基因的密度比值代表基因表达的相对水平进行半定量分析,结果表明转染后的24h、48h以及72h后,培养之LECs中都有CD/TK的明确表达,各时间点目的基因表达量有所区别。结论：采取永生化人晶状体上皮细胞株经过冻融复苏细胞活力肯定,可满足实验需要；以质粒为载体,可成功将双自杀基因CD与TK转入体外培养的人晶状体上皮细胞,并可在多时间点稳定表达；质粒载体对目的基因的表达时间较短,CD与TK基因的表达各具特点,采用双自杀基因的联合导入可在一定程度上弥补质粒载体表达时间短的缺陷。第三部分：前体药物对晶状体上皮细胞的杀伤作用目的：探讨前体药物对转染之晶状体上皮细胞的特异性杀伤作用方法：首先对前体药物5-FC和GCV进行浓度筛选,然后根据实验需要对培养之晶状体上皮细胞进行分组,分别为空白对照组、脂质体组、CD/TK组、5-FC组、GCV组、5-FC+GCV组等六组,观察不同作用条件下晶状体上皮细胞的生长情况,并采用MTT比色法行细胞计数,对使用不同浓度及组合的前体药物组进行旁观者效应分析。结果：目的基因转染后使用前体药物第1天,除GCV0.1组外,其他各使用前体药物组细胞生存率均出现明显下降；第3天,细胞生存率均出现明显下降,以GCV100μg/ml+5-FC 100μg/ml组细胞生存率最低；第5天,GCV0.1μg组、GCV1.0组、GCV50μg组细胞生存率高于其他各组,生存率最低的为5-FC80μg、 GCV10μg/ml+5-FC60ng/ml组、GCV10μg/ml+5-FC100μg/ml组与GCV100μg/ml+5-FC100μg/ml组；第7天,细胞生存率最低的组别为GCV10μg/ml+5-FC60μg/ml组、GCV10μg/ml+5-FC100μg/ml组与GCV100μg/ml+5-FC 100μg/ml组。纵向比较：GCV1.0μg组、GCV0.1μg组、GCV10μg组、GCV50μg组、GCV100μg组第3、5、7天细胞生存率变化无统计学差异；单纯使用5-FC组除5-FC20μg与5-FC40μg组在第5天与第7天细胞生存率变化无差异外,其他各时间点的统计均有差异；其他各组各时间点的纵向比较均与上一时间点存在差异,整体表现为随培养时间延长,细胞生存率呈逐渐下降趋势。旁观者效应分析表现为随目的基因转染细胞比例降低,细胞生存率呈逐渐升高趋势,在目的基因转染细胞在60%时,细胞生存率与目的基因转染细胞100%无统计学差异,其他目的基因不同比例混合的细胞生存率与前体药物组合不同而略有差异。结论：单纯或联合应用前体药物5-FC与GCV均能对转染的晶状体上皮细胞产生特异性杀伤作用。联合使用以质粒为载体的自杀基因／前药系统,能够取长补短,在基因稳定表达时间内完成有效杀伤且具有旁观者效应,既能能减少前体药物使用剂量,又能弥补质粒转染效率较低的缺点；旁观者效应的出现使得自杀基因/前药系统的作用进一步增强,对靶细胞的杀伤效率进一步提升