多聚胺包括腐胺、亚精胺和精胺，几乎是所有活细胞的必要组分。它们可以结合在RNA和染色体DNA上，在细胞周期、基因表达、细胞增殖与分化上起到重要的作用。多胺的缺失将导致细胞生长减慢甚至死亡，但是当它们的含量升高时也会有致癌作用并且可以诱导细胞凋亡。鸟氨酸脱羧酶(ODC)是多聚胺生物合成中的限速酶，催化多聚胺生物合成途径中的第一步：鸟氨酸向腐胺的转变。ODC的半衰期仅仅几分钟，是已知所有酶中半衰期最短的。在多胺生成的过程中扮演着重要的调控酶角色，其活性可在转录、翻译和翻译后水平被精确调控。鸟氨酸脱羧酶抗酶(OAZ)可以连接到ODC蛋白上，抑制其催化活性并靶向地促使26S蛋白酶降解ODC，在翻译后水平影响ODC活性。此外，OAZ还能抑制细胞对多胺的吸收，促进细胞对多胺的排泄，从而降低细胞内多胺的浓度。研究表明细胞内该抗酶的过度表达除了能降低细胞内多胺水平，还能抑制细胞的生长。抗酶成员目前发现至少有三种，最主要的就是由227个氨基酸组成的抗酶1。抗酶1 C术端的部分是与ODC结合的区域，N术端的部分则促进ODC的降解。抗酶2 未发现有通过蛋白酶体降解ODC的功能，但却有抑制多胺转运的能力。抗酶3，只存在于睾丸组织中，其表达特定的出现于精子细胞发生过程中，与生育有关。OAZ的表达需要有一个独特的核糖体阅读框的移位过程。所有的OAZ成员有两个重叠的ORF框，一个带有翻译起始密码子和在移位处的终止密码子的ORF1，ORF2则编码了大部分的0AZ多肽序列却缺乏起始密码子。因此翻译全长的有功能的抗酶蛋白需要有+1的核糖体移位，移位处的核苷酸序列高度保守，有助于从其它组织中对抗酶成员的鉴别。+1的移位过程受到精胺的诱导调控，机制尚不明晰。当多胺水平上升时，可促进核糖体移位，OAZ表达增多，于是反馈抑制细胞内多胺浓度的上升。这样的机制有助于防止细胞内多胺浓度的起伏而造成的细胞毒性。许多实验已证实OAZ对ODC的降解作用与其对细胞的增殖抑制明显相关，使其体现出抗肿瘤恶性增殖的特性。Ruchi M等发现在实体肿瘤细胞如肝癌和前列腺癌中，OAZ基因的表达升高与细胞生长抑制明显相关，通过与细胞周期素Dl(cyclinD1)结合并使之降解，使细胞停滞于G1期，减缓细胞生长。在鼠皮肤癌还有胃上皮癌的模型中，OAZ的过度表达均导致了癌细胞的生长抑制，提示OAZ基因在肿瘤细胞的治疗上能发挥作用。我们的目的是通过定点突变技术，得到相应的去除frameshift位点后的突变OAZ基因，并构建至真核表达载体pEGFP-N1质粒中，转染至K562细胞中，通过检测K562细胞生长分化及cyclinDl基因变化情况，来研究0AZ基因对白血病肿瘤细胞的生物学效应。K562细胞诱导分化：K562细胞是一株恶性程度较高的人红白血病细胞系，建株于慢性淋巴细胞性白血病的患者。第九号与第22号染色体相互易位形成的Ph染色体是CML的肿瘤恶性克隆标志。这种染色体平衡易位导致9q34上的c-abl原癌基因与22q11上的Bcr基因断裂后重组，形成新的融合基因bcr-abl，后者转录翻译的P21O蛋白具有异常增高的蛋白酪氨酸激酶(PTK)活性。K562细胞具有多项分化潜能并能被多种诱导物诱导分化，因此K562细胞成为一个重要的关于白血病研究的细胞模型。K562细胞能被诱导表达胚胎型和胎儿型的血红蛋白，对这种机制的阐明有助于临床上缣型红细胞性贫血和B地贫的治疗研究。当前，对白血病治疗的观念正逐步从杀死白血病细胞向使其往良性方向分化转变。许多化学物质对K562细胞诱导分化的同时，会出现诱导细胞凋亡的副作用，如维甲酸、佛波酯、羟基脲均在诱导细胞分化同时出现促凋亡的现象。有研究发现OAZ在抑制细胞生长的同时，被抑制细胞未出现凋亡的迹象，这给K562细胞的诱导分化研究提供了新的思路。 研究方法：通过荧光定量PCR技术检测OAZ基因在Hernin诱导K562细胞红系分化过程中的表达变化，结果说明OAZ的表达升高与K562红系分化呈正相关。根据Gerlebank的数据，查找OAZ基因序列，并选用Primer primier5.0设计扩增ORF2与OAz全长的引物。引物的5’端分别修饰上相应的酶切位点，以利于扩增产物重组至表达载体pET32a和pEGFP-N1。测序鉴定后命名为pET32a-OAZ-ORF2和pEGFP-N1-OAZ。将pET32a-OAZ-ORF2转化至BL21菌，IPTG诱导下表达出OAZ的ORF2部分蛋白。收集并纯化蛋白后，免疫新西兰兔，制备多克隆抗体。对测序鉴定后的pEGFP-N1-OAZ重组体，采用定点碱基突变技术，将框移位点处TCCTGATG的T碱基缺失，使OAZ基因的两段开放阅读框没有重叠，无需精胺的诱导即可表达出全长OAZ蛋白，减少实验过程中外源物质的添加对实验结果的干扰。测序后命名为pEGFP-N1-OAZ-mutation，并采用脂质体法，转染至K562细胞，G418筛选得到稳定表达OAZ的细胞株，命名为K562<,OAZ>。同时针对OAZ基因序列，设计针对性的27mer siRNA，转染K562细胞和K562<,OAZ>细胞，抑制OAZ基因表达。实验中，我们采用荧光定量PCR技术检测siRNA干扰OAZ基因表达的效率。当OAZ在K562细胞中过表达及抑制表达时，通过细胞生长检测、分化检测、细胞周期分析和cyclinDl基因变化检测，初步探讨OAZ在K562细胞生长分化中的功能。 实验结果：采用50mmol/L Hemin诱导K526细胞，细胞生长明显减慢，联苯胺阳性细胞增加，血红蛋白数量增加，说明K562细胞被诱导向红系方向分化。采用荧光定量PCR技术检测OAZ基因表达变化，发现OAZ mRNA水平随诱导时间的延长表达量逐渐增多，OAZ在Hernin诱导24、48和72h后，其mRNA表达分别上升了18.67％、51.12％和92.11％。为深入研究OAZ对K562的生物学效应，我们构建了OAZ突变基因重组质粒，测序鉴定后，转染至K562细胞。发现随时间的增加，细胞生长明显减慢，联苯胺阳性细胞增多。进一步的实验发现，生长受到抑制的K562细胞在G1期被阻滞，与cyclinDl的表达下凋相一致。为验证实验的可靠性，我们设计了针对OAZ基因的27mere siRNA，转染K562<,OAZ>抑制OAZ基因的表达。当转染siRNA 24h后，处理组OAZ基因较对照组的抑制率为46.04％，48h为55.41％，72t1为50.07％，说明siRNA的干扰效率可信。随OAZ基因表达的减少，细胞的联苯胺阳性率逐渐减少，由开始时的6.6％±1.0％分别下降4.3％±0.5％(24h)、4.1％±0.7％(48h)和4.6％±0.9％(72h)，细胞的增殖速度亦随之增加，有逐步恢复恶性的趋势。同时，RT-PCR检测cyclinD1的表达也随之增多，提示细胞周期的抑制也随之解除。 结论：(1)首次采用荧光定量PCR的方法检测了OAZ基因在Hemin诱导K562细胞红系分化时的表达变化，结果提示OAZ的表达增多与K562细胞的红系分化呈正相关。(2)构建了原核表达重组载体pET32a-OAZ-ORF2和真核表达重组载体pEGFP-N1-OAZ、pEGFP-N1-OAZ-mutation，并成功在BL21菌和K562细胞中表达。这对深入研究OAZ基因的功能提供了良好的研究基础。(3)首次采用27mer的siRNA对OAz基因的表达进行抑制实验，并通过荧光定量PCR证实了基因抑制效果，给OAZ基因的功能研究提供了新的选择。(4)实验结果证明OAZ基因与K562的分化存在相关性，在抑制肿瘤细胞恶性增殖的基础上，还具有使K562细胞向红系方向分化趋势。