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背景:白血病通常被认为是一种克隆性干细胞疾病,在这种疾病中,自我更新的白血病干细胞（Leukemia stem cells,LSC）被认为是启动肿瘤形成的一个重要因素。目前,使用细胞毒性药物来破坏癌细胞的化学疗法是最有效的治疗方法。然而,多药耐药性（Multidrug resistance,MDR）是肿瘤难以治愈的重要原因,是癌症治疗中亟需解决的主要问题。其中,白血病干细胞的存在是导致白血病多药耐药性产生和疾病复发的主要原因。因此,寻找针对白血病干细胞（LSCs）的新型治疗方法是治愈白血病的关键。早幼粒细胞白血病蛋白（Promyelcocytic leukemia protein,PML）基因在20世纪90年代初首次被描述为急性早幼粒细胞白血病中的染色体易位t（15;17）的靶点,它产生了致癌的PML-视黄酸受体α（RARα）融合蛋白（PML-RARα）。据报道,PML在MDR慢性粒细胞性白血病（Chronic myelogenous leukemia,CML）中过表达。因此,PML可能是MDR白血病中的关键分子。并且,PML在调节对抗癌药物的抗性中起重要作用。然而,PML对白血病细胞的耐药调节机制仍然不是很清楚。为了解决多药耐药性的问题,近年来研究发现,新乌头碱是中药附子中存在的主要生物活性成分,具有强效镇痛,抗风湿及抗肿瘤等药理作用。前期的研究已经表明新乌头碱对白血病细胞K562的生长有明显的抑制作用。因此,本实验主要以耐药的慢性髓系白血病细胞系K562-ADR为研究对象,探讨PML基因是否参与CML耐药性的发生。并以此为基础,进一步探讨通过新乌头碱的作用能否降低CML细胞系K562-ADR耐药性。目的:探讨BCR-ABL阳性的慢性髓系白血病细胞K562和K562-ADR中的PML的表达量;并探索中药附子成分新乌头碱对K562-ADR细胞耐药性的影响。方法:首先将两种慢性髓系白血病细胞K562和K562-ADR培养一段时间使其稳定,并用CCK8法检测K562-ADR细胞株对ADR（阿霉素）的耐药性。其次,利用RQ-PCR和Western Blot技术检测K562和K562-ADR细胞之间的PML表达量。第三,采用CCK8法检测不同浓度的新乌头碱作用于K562和K562-ADR细胞株24h、48h和72h后的生长抑制率,并选取50μg/mL、75μg/ml和100μg/ml三种新乌头碱浓度用于后续实验。第四,将实验分为五组:A:K562-ADR;B:K562-ADR+ADR;C:K562-ADR+50μg/ml新乌头碱;D:K562-ADR+75μg/ml新乌头碱;E:K562-ADR+100μg/ml新乌头碱;阿霉素均为3μg/ml,每孔加入5×106个细胞,并加入药物分别处理细胞48h和72h后,用RQ-PCR和Western Blot技术检测PML的表达量。第五,将实验分为另外五组:A:K562-ADR;B:K562-ADR+ADR;C:K562-ADR+50μg/ml新乌头碱+ADR;D:K562-ADR+75μg/ml新乌头碱+ADR;E:K562-ADR+100μg/ml新乌头碱+ADR;阿霉素均为3μg/ml,每孔加入5×106个细胞,并加入药物处理细胞48h后,用RQ-PCR和Western Blot技术检测PML的表达量。第六,将实验分为七组:A:K562 B:K562+ADR C:K562-ADR D:K562-ADR+ADR E:K562-ADR+50μg/ml新乌头碱+ADR F:K562-ADR+75μg/ml新乌头碱+ADR G:K562-ADR+100μg/ml新乌头碱+ADR;阿霉素均为3μg/ml,每孔加入1500个细胞,并加入药物分别处理细胞24h、48h和72h后,用CCK8法检测细胞抑制率。最后,再将实验分为四组:A:K562-ADR+ADR;B:K562-ADR+50μg/ml新乌头碱+ADR;C:K562-ADR+75μg/ml新乌头碱+ADRD:K562-ADR+100μg/ml新乌头碱+ADR;阿霉素均为3μg/ml,每孔加入5×106个细胞,并加入药物处理48h后,用流式细胞仪检测细胞凋亡。结果如下:通过CCK8法验证K562-ADR的耐药性,结果发现阿霉素对K562呈浓度依赖性,随着阿霉素浓度的增加,抑制作用增强,IC50为2.521μg/mL。然而,阿霉素对K562/ADR没有浓度依赖性,抑制作用随着阿霉素浓度的增加没有显著变化,并且没有一定的IC50;通过RQ-PCR和Western blot检测PML在K562-ADR细胞内的表达情况,结果发现K562-ADR细胞中的PML表达高于K562细胞;通过CCK8法检测不同浓度的新乌头碱对K562和K562-ADR两种细胞增殖的抑制状况,结果发现,在50-100μg/ml的浓度范围内,新乌头碱对K562和K562-ADR细胞增殖的抑制作用最为明显;通过RQ-PCR和Western blot检测发不同浓度的新乌头碱对K562-ADR细胞中PML表达的影响情况,结果发现新乌头碱对K562-ADR细胞中的PML表达有明显的抑制作用,但不同浓度的新乌头碱对K562-ADR细胞内的PML表达的抑制作用没有明显的差异;通过CCK8法检测不同浓度的新乌头碱联合3μg/ml阿霉素对K562-ADR细胞增殖的抑制状况,结果发现新乌头碱联合3μg/ml阿霉素可以明显的抑制K562-ADR细胞的增殖,并且随着新乌头碱的浓度增大,抑制效果越明显;通过RQ-PCR和Westen Blot检测不同浓度的新乌头碱联合3μg/ml阿霉素对K562-ADR细胞内的PML表达的影响,结果发现,与K562-ADR和3μg/ml阿霉素共培养的实验组相比,100μg/ml新乌头碱联合3μg/ml阿霉素能降低PML的高表达;通过流式细胞仪检测不同浓度的新乌头碱联合3μg/ml阿霉素对K562-ADR细胞的凋亡的影响,结果发现100μg/ml新乌头碱联合3μg/ml阿霉素能促进K562-ADR细胞的凋亡。结论:在BCR-ABL阳性的耐阿霉素慢性髓系白血病细胞K562-ADR中PML是高表达的。中药附子成分新乌头碱在50-100μg/ml浓度范围内对K562和K562-ADR的增殖具有明显的抑制作用并能降低PML的高表达。100μg/ml新乌头碱联合3μg/ml阿霉素能降低PML的高表达,并能促进K562-ADR细胞的凋亡。因此,中药附子成分新乌头碱可以通过降低PML的高表达来降低K562-ADR的耐药性,进而促进K562-ADR细胞的凋亡。