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鼻咽癌(Nasoparyngeal carcinoma, NPC)是我国南方一些省(自治区)的常见恶性肿瘤之一。目前放射治疗是鼻咽癌治疗的基本方法,但中晚期鼻咽癌治疗后常常复发或向远处转移,对于复发和转移的患者在临床上尚无有效治疗方案。树突状细胞(Dendritic cell, DC)为基础的疫苗在治疗肿瘤方面,尤其在某些晚期肿瘤如黑色素瘤、前列腺癌、结肠癌、尿道癌的临床治疗方面已经取得一些的成效,现在已进入Ⅱ期临床试验。但DC在治疗NPC方面,还处于起始阶段。目前治疗用的DC是其前体细胞在细胞因子作用下体外诱导培养获得的,但对于DC诱导培养条件文献报道不一。本研究首先通过对DC培养条件、前体细胞来源、细胞因子组合、细胞贴壁孵育时间、rAd-LMP2感染DC剂量,细胞冻融方面的进行探索,优化了DC培养条件。我们课题组以rAd-LMP2以灌胃、肌肉注射和滴鼻的方式感染小鼠,均可诱发小鼠针对LMP2的特异性体液免疫和细胞免疫;EBV-LMP2 DNA疫苗、腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)疫苗、非复制5型腺病毒疫苗(Ad5)联合免疫Balb/C小鼠能够更好地诱导机体产生特异性CTL。rAd-LMP2、rAd5F35-LMP2肌肉免疫恒河猴诱导EBV-LMP2特异性的CTL。pcDNAⅢ-LMP2真核表达质粒免疫小鼠可诱发LMP2特异性细胞和体液免疫。在此基础上,我们以DC-LMP2肌肉免疫方式,研究LMP2诱导的特异性CTL。通过与广西自治区人民医院合作,在获得伦理委员会批准下,依据自愿原则,选择部分NPC治疗进行初步DC-LMP2皮内免疫治疗,首次以LMP2肽库形式检测DC-LMP2免疫后所激发LMP2特异性CTL,探讨患者特异性CTL与NPC发展进程的关系。结果显示:普通培养瓶诱导培养DC的效果最差,带滤膜盖的细胞培养瓶次之,六孔细胞培养板诱导培养效果最好。rmGM-CSF+rmIL-4+rmTNF-α组合对骨髓前体细胞诱导培养DC的效果最好,终浓度为rmGM-CSF(200U)+rmIL-4(10U)+rmTNF-α(100U)/mL;对脾脏来源DC进行诱导培养,rmGM-CSF+rmTNF-α组合的阳性率最高,但最终获得DC数量远远少于骨髓来源DC。随着前体细胞孵育时间的增加获得DC细胞数量也随之增多,DC纯度无明显差异。rAd-LMP2感染骨髓细胞诱导培养的DC,以10、100、1000 MOI感染DC,100 MOI感染DC效果最好,40-60%的DC中有LMP2表达。苔盼蓝法检测-80℃、-196℃冻存骨髓和脾脏淋巴细胞复苏后存活率,骨髓细胞存活率(94.8±0.7%和82.85±3.8%)均大于脾脏细胞(80.98±2.2%和68.3±5.2%),DC前体细胞冻存复苏影响其诱导培养。以优化获得的DC培养条件诱导培养骨髓来源的DC,然后DC-LMP2免疫BALB/C鼠可诱导LMP2特异性免疫应答。第5周(308±167/106细胞,对照18±6/106细胞)强于第8周(196±81/106细胞,对照7±2/106细胞);肌肉注射方式免疫小鼠rAd-LMP2、DC-LMP2所诱导的LMP2特异性CTL, rAd-LMP2组(1178±228/106细胞)大大高于DC-LMP2组((308±167/106细胞)。在小鼠0,2,4周免疫后的第五周,DC-LMP2免疫组CD8+T/CD3+T细胞亚群的比值(22.6±1.7%)高于PBS(20.4±3.5%)和DC组(22.04±1.2%),在第八周DC-LMP2免疫组CD8+T/CD3+T细胞亚群的比值(15.5±1.7%)低于PBS(17.6±2.9%)和DC组(17.5±1.5%)。在小鼠0,2,4周DC-LMP2免疫后,小鼠血清中产生LMP2抗体。在NPC患者前臂内侧下缘皮内免疫0.1 mL生理盐水,含1-2×105个DC-LMP2,未出现明显过敏反应,表明皮内免疫DC-LMP2的途径、部位、剂量安全可行。参加皮内免疫的部分NPC患者,在在第五周LMP2特异性CTL检测中,15人中9人提高了LMP2特异性CTL(/106),6人在DC-LMP2免疫后LMP2特异性CTL降低。1人在第八周的特异性细胞免疫水平高于治疗前,1人低于治疗前。在NPC免疫前后的IgA/VCA和IgA/EA抗体滴度无明显改变,NPC患者经过初次临床常规治疗后3-21个月内,血清中EBV DNA载量均低于103copies/mL。总之,rmGM-CSF+rmIL-4+rmTNF-α组合对骨髓前体细胞诱导培养DC的效果最好,终浓度为rmGM-CSF(200U)+rmIL-4(10U)+rmTNF-α(100U)/mL; DC-LMP2免疫BALB/C鼠可诱导LMP2特异性CTL。CD8+T/CD3+T细胞亚群的比值先升高。DC-LMP2免疫NPC患者的的途径、部位、剂量安全可行,部分NPC患者提高了LMP2特异性CTL。