[背景]多发性骨髓瘤(MM)是一种恶性浆细胞增生性肿瘤，占血液系统肿瘤的13%，目前仍是一种无法治愈的疾病。MM的主要临床表现为骨痛和溶骨性损害，即骨髓瘤骨病（MBD）。而MBD的效应细胞为破骨细胞(OC)。OC为一类具有骨吸收能力的多核巨细胞，来源于单核/巨噬细胞系，定位于骨髓中。在MM，骨髓微环境因骨髓瘤细胞浸润骨髓而发生改变，OC前体细胞接受到不正常的信号刺激而过度分化成熟，从而造成骨质破坏。巨噬细胞抑制因子1（MIC-1）是人转化因子β超家族成员，生物学功能复杂多样，在MM患者骨髓液中可检测到异常高表达，可能是OC新的促进因子，参与MBD的发病过程。[目的]探讨靶向抑制RPMI-8226细胞MIC-1表达对与其共培养的OC分化成熟的影响。[方法]1.通过密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞(PBMNC)，将其放入Transwell小室中的下室，在巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和细胞核因子-кB受体活化因子配体（RANKL）体系下与上室的RPMI-8226细胞进行共培养，并设立PBMNC单独培养为对照组。用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色，甲苯胺蓝染色法检测牙本质片的骨吸收陷窝情况及分析陷窝面积，流式细胞仪检测CD51/CD61表达情况分析比较两组OC成熟情况。2.实时荧光定量PCR检测各细胞株中MIC-1表达情况。通过反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术体外扩增MIC-1cDNA片段后与酶切、纯化后的表达载体GV115连接，构建重组质粒EGFP-MIC-1-FLAG并进行PCR及测序鉴定，最后将重组质粒转入293T细胞中，利用荧光显微镜和Western blot进行表达鉴定。3.设计并合成五条MIC-1siRNA靶点序列，并分别连入酶切好的RNAi慢病毒载体GV143。将各连接产物转入制备好的细菌感受态细胞，并进行PCR及测序鉴定。然后分别与表达载体EGFP-MIC-1-FLAG共转染293T细胞，采用Western blot方法筛选最佳靶点。将含有最佳干扰靶点的转移载体及包装质粒、包膜蛋白质粒，组成三质粒包装系统，共转染293T细胞，培养48h后，收集并浓缩慢病毒液，测定慢病毒滴度。将不同复感染指数（MOI=0，5，10）慢病毒液感染RPMI-8226细胞，实时荧光定量PCR检测病毒敲减效率。4.密度梯度法分离人PBMNC并将其放入Transwell小室中的下室，将第三部分中慢病毒感染后的RPMI-8226细胞放入上室进行诱导培养。用TRAP染色，甲苯胺蓝染色法检测牙本质片的骨吸收陷窝情况及分析陷窝面积，流式细胞仪检测CD51/CD61表达情况分析OC分化成熟情况。[结果]1.在与RPMI-8226细胞共培养后，与对照组比较，可见较多多核巨细胞，TRAP染色见胞浆内有较多紫红色颗粒，见3个至数十个不等的淡蓝色胞核，核仁明显，牙本质片甲苯胺蓝染色后可见明显增多蓝色骨吸收陷窝，流式细胞仪检测CD51/CD61表达量达53.88%，较对照组增多，两组间有显著统计学差异（p＜0.05）。2.实时荧光定量PCR检测发现RPMI-8226细胞高表达MIC-1。应用RT-PCR在体外扩增出MIC-1全长，片段大小为946bp，与预期相符。同时测序亦证实，MIC-1基因已被成功插入真核表达载体。将已测序成功的含MIC-1基因的真核表达载体转染293T细胞后，细胞内可见明显荧光。Western blot结果显示，在转染重组质粒的293T细胞可检测到大小约63kDa的EGFP-MIC-1-FLAG融合蛋白表达，说明转染成功，目的基因可在真核细胞内稳定表达。3.构建及合成五条MIC-1siRNA靶点序列，与已酶切成功的慢病毒载体连接，PCR鉴定和测序证实均连接成功。将前部分已构建成功的融合基因表达载体及各重组质粒共转染293T细胞后，Western Blot结果显示MIC-1基因被特异性抑制，且在过表达质粒与慢病毒干扰质粒比例为4:1及2:1时，MIC-1-RNAi(shRNA1)靶点对目的基因的抑制效果最好。成功包装和浓缩了慢病毒颗粒，经荧光法测定病毒滴度为1×109TU/ml。将收获的慢病毒转染RPMI-8226细胞后，CCK-8法检测慢病毒感染对细胞活力无影响，荧光显微镜下观察细胞荧光，感染效率可达80%以上。实时荧光定量PCR和Westernblot结果显示RPMI-8226细胞MIC-1mRNA表达明显下降，验证敲减效率达75%以上。4. PBMNC与慢病毒感染RPMI-8226细胞共培养后，与空病毒组相比较，慢病毒感染组多核巨细胞TRAP染色阳性多核细胞数减少，TRAP活性显著降低，牙本质片骨吸收陷窝明显减少，流式细胞术检测CD51/CD61表达量降低，两组间的差异有统计学意义（p＜0.05）。[结论]1. RPMI-8226细胞与PBMNC共培养后可促进其向OC分化成熟。说明此种共培养体系建立成功，此方法可在体外模拟骨髓瘤微环境，对体外研究MM中OC分化成熟机制及调节因素提供了简洁有效的方法。2.成功构建MIC-1融合基因表达载体，并可在真核细胞中表达。3.成功设计并合成了五条shDNA干扰靶点并筛选出最佳靶点。包装并成功收获具有较高滴度的慢病毒载体。将收获的慢病毒转染RPMI-8226细胞后，MIC-1基因被稳定、高效、特异性抑制。4.慢病毒介导的RNA抑制RPMI-8226细胞MIC-1基因表达后，可抑制与之共培养的PBMNC向OC分化成熟，提示MIC-1可促进OC分化成熟，可作为治疗MBD的新靶点。